材料和试剂

移液管（1ml，200μl和10μl）（Gilson Scientific Ltd.，目录号：F123602，F123601和F144802）
Eppendorf管（2ml）（Eppendorf AG，目录号：0030120094）
Eppendorf锥形管（50ml）（Eppendorf AG，目录号：0030122178）
0.45μm注射器过滤器（Sigma-Aldrich，目录号：F8273）
奶酪布（DUTSCHER SCIENTIFIC，目录号：789056）
冰盒和冰
液氮
三乙醇胺 - 乙酸（TEA-HOAc）（Sigma-Aldrich，目录号：90278）
乙酸钾（KOAc）（Sigma-Aldrich，目录号：P1190）
乙酸镁[Mg（OAc）2]（Sigma-Aldrich，目录号：M5661）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：SO389）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：43815）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5391）
Tris-盐酸（Tris-HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：252859）
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐（NADPH）（Sigma-Aldrich，目录号：93205）
黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）（Sigma-Aldrich，目录号：F6625）
吲哚-3-丙酮酸（IPyA）（Sigma-Aldrich，目录号：I7017）
色氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T0254）
乙酸乙酯（Sigma-Aldrich，目录号：270989）
碳酸钠（Na 2 CO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S7795）
蒸馏水
用于HPLC的乙酸乙酯（Sigma-Aldrich，目录号：650528）
HPLC的乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：A6283）
HPLC的甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
库存解决方案（参见配方）
缓冲区（参见配方）
1. 用于微粒体提取的缓冲液（缓冲液1，缓冲液2，缓冲液3和缓冲液4）
2. 用于HPLC分析的缓冲液

设备

瓷砂浆杵（Sigma-Aldrich，目录号：Z247464和Z247502）
缓冲液（100ml，250ml和500ml）的玻璃瓶（Sigma-Aldrich，目录号：Z305170，Z305189和Z305197）
冷冻台式离心机（Eppendorf AG，型号：5430R）
具有摆出转子SW41（Beckman Coulter，目录号：331362）的超速离心机
超速离心机corex管（Beckman Coulter，目录号：331372）
玻璃棒和2ml Potter-Elvehjem匀浆器（Sigma-Aldrich，目录号：P7734-1EA）
水浴（37℃）（Thermo Fisher Scientific，型号：TSGP02）
Speed-vac（LABCONCO，目录号：7810016）
Nanodrop ND-2000（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：13400504）
高效液相色谱（HPLC）（600E多溶剂递送系统）（WATERS，目录号：720000699EN）
反相柱（Apollo C18）（250mm×4.6mm，5μm）（Thermo Fisher Scientific，Grace ^{TM，目录号：5126767）}
UV监视器486（WATERS）和荧光监视器470（WATERS）

程序

内质网（ER）微粒体制剂
1. 除非另有说明，所有步骤均在冰上或4℃下进行
2. 预冷所有在程序中使用的缓冲液，管等
3. 5g玉米胚芽鞘或原代根组织（4 d后发芽）在液氮中用a研磨成细粉预冷砂浆和杵。
4. 然后将粉末在4ml冰冷的缓冲液1中匀化，并转移到50ml falcon管中。
5. 将4ml冰冷的缓冲液2加入管和悬浮液中在冰上孵育10分钟。然后将匀浆在37℃下离心 1,000×g/g，在4℃温育10分钟。将所得上清液倒在4上干酪布层进入新鲜的猎鹰管。在这一步，所得提取物被认为是用于以后酶促的总植物提取物测定。将提取物在4,500xg下再次离心25分钟，4℃ ℃。
6. 准备超速离心机corex管与4毫升蔗糖垫（缓冲区3）在底部
7. 将8ml植物悬浮液层叠在蔗糖的顶部通过稍微倾斜管子并小心地和缓慢地移液来缓冲悬浮液在管的侧面。将管离心90分钟 min，93,000×g （带有转出转子SW41的超速离心机）。
8. 将所得沉淀从超速离心管中取出必需用20μl缓冲液4并转移到2ml Potter-Elvehjem匀浆器。保持上清液并用作胞质提取物在以后的IAA定量
9. 最终沉淀重悬于200μl缓冲液4中，使用玻璃棒和2ml Potter-Elvehjem匀浆器。蛋白质含量使用a Nanodrop。新鲜制备的微粒体用于酶测定直接。
10. 根据样本大小，这部分过程将需要3到4小时。
微粒体酶测试
1. 生长素生物合成的YUCCA途径是两步过程（图1）：在玉米TAR-蛋白[拟南芥相关蛋白的色氨酸氨基转移酶; Zm TAR1（Chourey 等人，2010）， Zm VT2 （Phillips等人，2011）和 Zm TAR3（ Zm Alliin1; Bernardi ）] 将色氨酸（Trp）转化为吲哚-3-丙酮酸（IPyA）然后通过YUCCA蛋白转化成IAA [em] Zm YUC1和 Zm SPI1（Phillips等 al。，2011）]。已显示 Zm YUC1和 Zm VT2已本地化在而 Zm SPI1， Zm TAR1和 Zm TAR3本地化到ER （Kriechbaumer et al。，2015）。
  
  图1。 YUCCA-玉米中生长素生物合成的途径。胞质酶以绿色标记，ER定位的酶以蓝色标记。
2. 酶活性试验（100μl总体积）与微粒体和胞质级分按如下方式进行：
  20微升的微粒体或胞质提取物或总植物提取物（参见步骤A5） 1mM NADPH 100μMFAD
  100μMIPyA或Trp（取决于实验兴趣）
  100mM Tris-HCl（pH8.0）直到总体积为100μl
  在2ml Eppendorf管中小心混合
  注意：为此，应首先移取100 mM Tris-HCl，然后通过植物提取物然后FAD。反应时间从开始加入底物（IPyA或Trp）。
  将测定在37℃水浴中孵育1小时，并在孵育时间后直接在液氮中快速冷冻。
3. 为了比较，还用胞质部分和总植物提取物进行酶测试
4. 在该阶段，可以在进行IAA分析之前将测定储存在-20℃。
IAA提取和量化
1. 通过乙酸乙酯相分离提取IAA（Park等人，2003; Kriechbaumer等人，2007）（图2）每个测定的全部样品用于该程序。
  1. 为此，用1M调节样品的pH高于9.5 Na 2 CO 3 3，然后用400μl乙酸乙酯萃取样品。
  2. 回收水相下层相并加入200μl水
  3. 重复分配过程以再次回收水相。
  4. 将来自两个分配步骤的水相合并。
  5. 将收集的水相用乙酸酸化至pH 低于2.5，并加入400μl乙酸乙酯分配两次为每个步骤。
  6. 收集有机相和液体使用speed-vac（预设置为室温）蒸发。蒸发将需要大约两个小时，但样品应检查时。
  7. 将干燥的物质重新溶解在100％甲醇中，如果需要，可以在进一步分析之前储存在-20℃。
2. 根据样品量和蒸发时间的不同，IAA提取可能需要长达5小时
  
  图2.使用乙基的IAA提取的示意图乙酸酯相分离。用乙酸乙酯萃取IAA的步骤相分离如图所示。水相显示蓝色，有机相为红色。表明pH调节以及在Eppendorf管中的变化
3. 然后通过具有反相柱的高效液相色谱（HPLC）分析IAA
4. 为此，HPLC系统以0.8ml min -1的等梯度流与缓冲液A（10％甲醇，0.3％乙酸盐）的40:60混合物和缓冲液B（90％甲醇，0.3％乙酸盐）。鉴定峰与标准物质的保留时间比较和使用UV监测器和荧光监测器的UV光谱
5. 使用的体积计算每个样品中IAA的量 IAA峰，并将其与得自的IAA峰的体积进行比较 IAA标准。这将给出IAA的数量样品。微粒体，胞质和总蛋白中的蛋白量通过用UV-Vis测量280nm处的吸光度来测定级分分光光度计（例如通过Nanodrop Instrument ND-2000）。有了这个数据可以计算每μg蛋白质的IAA量（图4）。

代表数据

为了检查微粒体部分的纯度，用检测胞质腈水解酶的抗ZmNIT抗体探测微粒体以及胞质部分（图3）。该抗体显示检测玉米腈水解酶1和2蛋白质在各种组织中在总蛋白质的ng mg -1 sup范围内非常特异性（Park等人，2003; Kriechbaumer等人。，2007）。腈水解酶条带仅在胞质级分中可检测到，表明相当纯的微粒体部分

图3.微粒体级分的纯度的免疫印迹分析使用免疫印迹分析测试微粒体（M）和胞质（C）级分的腈水解酶蛋白。用识别胞质玉米腈水解酶1和2的抗-Zm NIT1抗体（1:400）探测来自每个级分的100μg蛋白质。（Kriechbaumer等人，2015 ）。

玉米胚芽鞘和原生根中色氨酸转化为IAA的代表性数据显示在图4中[来自Kriechbaumer等人（2015）的数据]。

图4.玉米中的生长素生物合成能力。发芽后4天，通过微粒体（微粒体）级分，胞质（Cytosol）级分或来自玉米胚芽鞘（Col，白色条）和主根（PR，黑色条）的总植物提取物将色氨酸酶促转化为IAA。显示标准错误。 n = 2（两个生物样品，每个具有三个技术重复）。

笔记

将植物材料直接收集到保持在冰上的冷冻猎鹰管中，尽可能快地收集材料。
预冷管，玻璃器皿，缓冲液，离心机等，并尽可能保持您的样品在冰上
在可能的情况下，应当使用时间上新鲜制备的微粒体用于酶测定。在20％甘油中冷冻用于以后的测定是可能的，但不推荐
可以使用任何HPLC系统（例如Dionex，Beckman ...）进行测定。
建议至少使用质谱法确认一些数据点，以确保正确的分子被定量。

食谱

库存解决方案
1M TEA-HOAc（pH7.5） 1M KOAc（pH7.5）
0.1M Mg（OAc）2
1 M蔗糖
1 M DTT
0.5 M EDTA
1 M Tris-HCl（pH 8.0）
1 M Na 2 CO 3 sub
0.1 M NADPH
0.1 M FAD
0.1 M IPyA
0.1 M Trp
缓冲区
注意：过滤缓冲区1-4到0.45μm注射器过滤器。在使用之前，从1M新鲜的原液中加入DTT。
1. 微粒子提取缓冲液
  1. 缓冲区1
    25mM TEA-HOAc（pH7.5） 50mM KOAc（pH7.5） 5mM Mg（OAc）2 0.25 M蔗糖 4 mM DTT
  2. 缓冲2
    100mM TEA-HOAc（pH7.5） 20 mM EDTA
  3. 缓冲区3
    25mM TEA-HOAc（pH7.5）25mM KOAc（pH7.5） 2mM Mg（OAc）2
    0.5 M蔗糖 4 mM DTT
  4. 缓冲区4
    25mM TEA-HOAc（pH7.5） 0.25 M蔗糖 1mM DTT
2. 用于HPLC分析的缓冲液
  缓冲液A：10％甲醇，0.3％乙酸盐缓冲液B：90％甲醇，0.3％乙酸

致谢

该协议改编自Kriechbaumer等人。（2015）。这项工作得到了韩国科学技术协会（KOFST）授予Dr Verena Kriechbaumer和英国生物技术与生物科学研究委员会的研究奖学金（授予教授Chris Hawes的授予号BB/J004987/1研究资助）的支持。。

参考文献

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Bernardi，J.，Lanubile，A.，Li，Q.B.，Kumar，D.，Kladnik，A.，Cook，S.D.，Ross，J.J.，Marocco，A.and Chourey，P.S。（2012）。生长素受损在缺陷型胚乳18突变体中的生物合成是由于在玉米中编码胚乳特异性YUCCA1蛋白的Zm Yuc1基因中的突变表达缺失。植物生理学160 ）：1318-1328。
Chourey，P.S.，Li，Q.B.and Kumar，D。（2010）。种子发育中的糖激素交互作用：IAA生物合成的两个冗余途径在转化酶缺陷型miniature1（mn1）种子突变体在玉米中。 3（6）：1026-1036。
达尔文，C。和达尔文，F.（1880）。植物中的运动的力量约翰Murray。
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Kriechbaumer，V.，Park，W.J.，Piotrowski，M.，Meeley，R.B.，Gierl，A.and Glawischnig，E。（2007）。玉米腈水解酶在生长素稳态和β-氰基丙氨酸水解中具有双重作用。 J Exp Bot 58（15-16）：4225-4233。
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Park，W.J.，Kriechbaumer，V.，Moller，A.，Piotrowski，M.，Meeley，R.B.，Gierl，A.and Glawischnig，E。（2003）。 Nitrilase ZmNIT2将吲哚-3-乙腈转化为吲哚-3-乙酸。 Plant Physiol 133（2）：794-802。
Phillips，K.A.，Skirpan，A.L.，Liu，X.，Christensen，A.，Slewinski，T.L.，Hudson，C.，Barazesh，S.，Cohen，J.D.，Malcomber，S.and McSteen，消失的流苏2编码在玉米中营养和繁殖发育所需的草特异性色氨酸转氨酶。植物细胞 23（2）：550-566。