材料和试剂

96孔V-底板，洗脱捕获物（Greiner Bio-One GmbH，目录号：651101）
Greiner UV星透明，96孔（Greiner Bio-One GmbH，目录号：82050-788）注意：目前，它是"VWR国际，目录号：82050-788"。
多孔板96孔非敲击PCR板（Bio-Rad Laboratories，目录号：MLP-9601）
多屏深孔板（Merck Millipore Corporation，目录号：MDRLN0410）
2.4ml深孔存储板/池板（Greiner Bio-One GmbH，目录号：780280）
100ml溶液池（VWR International，Labcor ^TM，目录号：730-014）
55 V溶液盆（VWR International，Labcor ，目录号：730-004）
15ml离心管（VWR International，目录号：20171-020）
50ml离心管（VWR International，目录号：21008-178）
2.0ml Eppendorf管（VWR International，目录号：20901-540）
0.2ml 12-条管（VWR International，目录号：21008-940）
Lab磁带
坚韧的^®
Microseal'B'粘合密封（Bio-Rad Laboratories，型号：MSB1001）
施加的MicroAmp透明粘合剂膜（Biosystems，目录号：4306311）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM，目录号：4306311"。
Kimwipes（根据需要来源）
移液器吸头适合移液器（根据需要来源）
AccuGENE ^{水，分子生物学级（Affymetrix，目录号：71786）}
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep（Sigma-Aldrich，目录号：G1N70）
Affymetrix SNP 6 Core Reagent Kit，100反应（Affymetrix，目录号：901706）
1. 10x Sty I缓冲液/NE缓冲液3（New England Biolabs）
2. T4 DNA连接酶（400U /μl）（New England Biolabs）
3. T4 DNA连接酶缓冲液（10x）（New England Biolabs）
4. 适配器，sty（50μM）
5. PCR引物002（100μM）
6. 10x Nsp I缓冲液/NE缓冲液2（New England Biolabs）
7. Nsp I（10U /μl）（New England Biolabs）
8. 适配器，nsp（50μM）
9. 洗脱缓冲液（缓冲液EB）
10. 碎片缓冲区（10x）
11. 碎裂试剂（DNase I）
12. DNA标记试剂
13. 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）（30U /μl）
14. 末端脱氧核苷酸转移酶缓冲液（TdT缓冲液）（5x）
15. 寡核苷酸对照试剂（OCR），0100
16. 10 mg/ml BSA（100x）
17. 杂交主混合物
DNA标记（Bionexus，目录号：BN2050）
2％TBE凝胶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：G8008-02）}
凝胶加载溶液（Faster Better Media，目录号：SB5N-8）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459844）
50ml磁珠（AMPure，目录号：A63881）
注意：在网站上命名为"Agencourt AMPure XP-PCR Purification"
4％TBE凝胶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：G8008-04）}
MES水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M8250）
MES钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：M3885）注意：所有目录号都列在Affymetrix数据表中（ http://media.affymetrix.com/support/downloads/manuals/genomewidesnp6_manual.pdf ）。
Clontech TITANIUM™DNA扩增试剂盒（Clontech，目录号：639240）（参见配方）
12x MES库存解决方案（参见配方）

设备

应用生物系统部门
1. 2720 Thermal Cycler
2. GeneAmp ^？ PCR System 9700
3. GeneAmp PCR系统9700（银块或镀金银块）
48基因组范围人类SNP阵列6.0（每个样品一个阵列）
GeneChip ^® Hybridization Oven 640
Jitterbug
分光光度计读数器
真空歧管（Merck Millipore Corporation）
Vortexer
冷却器（冷却至-20°C）
冷却室（冷却至4℃）（不冻结）
冷却室（双重，冷却至4℃）（不冻结）
冰桶，装满冰
标记，细点，永久性
微量离心机
吸管，12通道P1200
吸管，12通道P200
吸管，12通道P20（精确到±5％以内）
吸管，血清学
吸管，单通道P1000
移液器，单通道P200
具有深井容量（54mmH×160g）的板式离心机
光学板
离心机板支架
注意：
1. 只使用此处列出的PCR板，粘性膜和热循环仪。
2. 所有相关设备编号都列在Affymetrix数据表中。
（ http://media.affymetrix.com/support/downloads/manuals /genomewidesnp6_manual.pdf ）

程序

基因组DNA平板制备

使用提取方案从感兴趣的细胞提取DNA，产生高质量，无污染物的没有抑制剂的DNA（ e GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep）。
注意：当使用分光光度计检查光密度时，DNA在260/280比率下应该在1.8左右，在260/230比例时应该在2.0左右。
通过高速涡旋3秒彻底混合基因组DNA。
确定每个样品的浓度（例如 Nanodrop）。
使用还原的EDTA TE缓冲液稀释每个样品至50ng /μl
通过高速涡旋混合稀释的DNA 3秒
在高速下涡旋基因组DNA平板10秒，然后在560×g下旋转30秒。
等分5微升的每个DNA到两个96孔反应板的相应的孔。 5μl的50ng /μl工作原液相当于每孔250ng基因组DNA。该协议需要每个样品两个重复：一个用于Nsp，一个用于处理Sty
用胶膜密封每个板。

阶段1：病毒限制性酶消化
在此阶段，基因组DNA被Sty I限制酶消化。

解冻/将下列试剂放在冰上：
1. NE缓冲区3
2. BSA
3. 基因组DNA（如果冻存）
4. AccuGENE水
标记以下管，然后放入冷却室：
1. 标有"Dig"的12条管的一条。
2. 一个2.0ml Eppendorf管标记"Dig MM"。
用基因组DNA制备板，如下：
1. 以高速旋转板的中心3秒。
2. 沿560英尺x g 旋转板30秒。
3. 放回冷却室在冰上。
准备试剂（除了酶）如下：
1. 涡旋3次，每次1秒
2. 脉冲旋转3秒。
3. 放置在冷却室中。
预热热循环仪盖，但在室温下离开块。
注意：将STY I酶保持在-20°C，直到准备使用。
通过将以下试剂的体积加入到如表1中的2.0ml Eppendorf管中来制备Sty消化主混合物：
1. AccuGENE水
2. NE缓冲区3
3. BSA
从冷冻机中取出Sty I酶，立即放入冷却器中。
脉冲旋转酶3秒。
立即将酶添加到主混合物中，然后将剩余的酶放回冷却器中
高速旋转主混合物3次，每次1秒
脉冲旋转3秒。
置于冷却室中。
将任何剩余的酶返回到冰箱

立即进行添加Sty Digestion主混合物到样品
表1. Sty I Digestion Master Mix

试剂	1样本	48份样品（15％额外）
AccuGENE ^®水	11.55微升	637.6微升
NE缓冲区3（10x）	2微升	110.4μl
BSA（100×; 10mg/ml）	0.2μl	11微升
Sty I（10 U /μl）	1微升	55.2μl
总计	14.75微升	814.2微升

将Sty Digestion Master Mix添加到样品中（第1阶段，第15-22步）

要将Sty Digestion Master Mix添加到样品中，请使用单通道P200移液器，将67μlSty Digestion Master Mix等分到标有 Dig 的条带管的每个管。
使用12通道P20移液管，在冰上冷却室中的每个DNA样品中加入14.75μl的Sty Digestion Master Mix。每个孔中的总体积现在为19.75μl

试剂
卷

基因组DNA（50 ng /μl）
5微升

消化主混合物
14.75微升

总量
19.75微升
用胶膜密封板。
以高速旋转板的中心3秒。
沿560英尺x g 旋转板30秒。
确保热循环仪的盖子已预热。
将板装载到热循环仪上，运行GW5.0/6.0 Digest程序GW5.0/6.0文摘计划

温度
时间

37°C
120分钟

65℃
20分钟

4°C
暂停
程序完成后，取出版面并以560 x g 旋转30秒。

阶段2：结婚连结
在此阶段，使用Sty适配器连接消化的样品。

解冻/将以下试剂放在冰上（约20分钟）：
1. 适配器垫片I
2. T4 DNA连接酶缓冲液（10x）
3. Sty消化样品（如果冷冻）
4. AccuGENE水
注意：将T4 DNA连接酶置于-20°C，直到准备使用。
标记以下管，然后放入冷却室：
1. 一条12条标有"Lig"的管子
2. 标记为"Lig MM"的2.0ml Eppendorf管
3. 解决方案盆地
按如下方法制备消解样品：
1. 以高速旋转板的中心3秒。
2. 沿560英尺x g 旋转板30秒。
3. 放回冷却室在冰上。
准备试剂：
1. 高速涡旋3次，每次1秒（除了酶）
2. 脉冲旋转3秒。
3. 放置在冷却室中。
预热热循环仪盖，但在室温下离开块。在样品装入前，盖子必须预热。
注意：T4 DNA连接酶缓冲液（10x）含有ATP，应在冰上解冻。在使用前根据需要涡旋缓冲液，以确保沉淀物重新悬浮，并且缓冲液是澄清的。避免每个供应商的说明有多个冻融循环。

准备Sty连接主混合物（阶段2，步骤6-13）

将所有试剂和管保持在冰上，通过向2.0ml Eppendorf管中加入基于表2中所示体积的以下试剂来制备Sty Ligation Master Mix：

适配器垫片I
T4 DNA连接酶缓冲液（10x）

表2. Sty I Ligation Master Mix

试剂	1样本	48份样品（多加15％）
T4连接酶缓冲液（10x）	2.5μl	150μl
适配器Sty I（50μM）	0.75μl	45微升
T4 DNA连接酶（400U /μl）	2微升	120微升
总计	5.25微升	315微升

从冰箱中取出T4 DNA连接酶，立即置于冰箱中冷藏。
脉冲旋转T4 DNA连接酶3秒。
立即将T4 DNA连接酶加入到主混合物中; 然后放回冷却器。
高速旋转主混合物3次，每次1秒
脉冲旋转3秒。
将主混合物置于冰上。
立即进行添加Sty连接主混合物到反应。

将Sty Ligation主混合添加到反应中（第2阶段，第14-27步）
使用单通道P100移液管将Sty Ligation Master Mix加入样品中，在冰上将25μlSty Ligation Master Mix等分到试管的每个管中。
使用12通道P20移液器，等分5.25μl的Sty连接主混合物在Sty消化阶段板上的每个反应。每个孔中的总体积现在为25μl

试剂
卷

Sty消化的DNA
19.75微升

Sty Ligation Master Mix
5.25微升

总计
25μl
用胶膜密封板。
以高速旋转板的中心3秒。
在560秒向下旋转盘子 30秒。
确保热循环仪盖已预热。
将板载入热循环仪并运行GW5.0/6.0 Ligate程序。
GW5.0/6.0升级程序

温度
时间

16°C

70℃
20分钟

4°C
暂停
当GW5.0/6.0 Ligate程序完成后，取出板并在560 x g下旋转30秒。
将板放在冰上的冷却室中。
稀释每个反应如下：
1. 将10 ml AccuGENE水倒入溶液池。
2. 使用12通道P200移液器，为每个反应添加75μl的水。
每个孔中的总体积为100μl

试剂
卷

Sty连接的DNA
25μl

AccuGENE水
75微升

总计
100微升
用胶膜密封板。
以高速旋转板的中心3秒。
沿560英尺x g 旋转板30秒。
将板在冰上的冷却室中储存高达60分钟。如果不直接进行下一步，将板存储在-20°C 注意：在PCR之前，用AccuGENE水稀释连接的DNA是至关重要的

阶段3：Sty PCR
在此阶段，您将等量的每个Sty连接的样品转移到三个新鲜的96孔板中; 准备Sty PCR主混合物，并将其加入每个样品; 将每个板放在热循环仪上并运行GW6.0 PCR程序; 并通过在2％TBE凝胶或E-Gel 962％琼脂糖凝胶上运行3μl每种PCR产物来确认PCR。

解冻/将以下试剂放在冰上（约20分钟）：
1. TITANIUM Taq PCR Buffer
2. dNTPs
3. PCR引物002
4. 结扎样品（如果冷冻）
5. AccuGENE水
6. GC-Melt
7. 解决方案盆地
注意：将TITANIUM Taq DNA聚合酶留在-20°C，直到准备使用。
标记以下管，然后根据需要放置在冷却室或冰上：
1. 标记为"P1"，"P2"，"P3"的三个96孔反应板
2. 一个标记为"PCR MM"的50ml Falcon管
按照以下步骤准备Sty连接的样品：
1. 以高速旋转板的中心3秒。
2. 沿560英尺x g 旋转板30秒。
3. 标记板Lig。
4. 放回冷却室在冰上。
准备试剂：
1. 高速涡旋3次，每次1秒（除了酶）
2. 脉冲旋转3秒。
3. 放置在冷却室中。
预热热循环仪盖，但在室温下离开块。

将PCR样品连接到PCR板（阶段3，步骤6-7）
每次使用12通道P20移液管一行，将10μl每个Sty连接的样品转移到每个PCR板的相应孔中。
用粘合剂膜密封每个板，并在冷却室中在冰上离开
准备Sty PCR预混液（第3阶段，第8-13步）

为了制备Sty PCR主混合物，将50ml Falcon管保持在冷却室中，并加入如表3所示的试剂（除了Taq DNA聚合酶）。

表3.48个样品的Sty PCR主混合物

试剂	1反应	3 PCR板， 48每个样板取样（15％额外）
AccuGENE水	39.5微升	6.541 ml
TITANIUM Taq PCR缓冲液（10x）	10微升	1.656 ml
GC-Melt（5M）	20微升	3.312 ml
dNTP（各2.5mM）	14μl	2.318 ml
PCR引物002（100μM）	4.5微升	0.745 ml
TITANIUM DNA聚合酶（50x）（在准备将等分试样混合到连接的样品前不要添加）	2微升	0.331毫升
总计	90微升	14.903 ml

从冷冻机中取出TITANIUM Taq DNA聚合酶，立即置于冷却器中
脉冲旋转Taq DNA聚合酶3秒
立即将Taq DNA聚合酶加入到主混合物中; 然后在冰上将管子放回冷却器
高速旋转主混合物3次，每次1秒
将混合物倒入溶液盆中，将盆保持在冰上。

将Sty PCR Master Mix添加到样品中（第3阶段，第14-18步）
要向样品中加入Sty PCR Master Mix，使用12通道P200移液管，并向每个样品加入90μlSty PCR Master Mix。为了避免污染，每次分配后更换移液管吸头。每个孔中的总体积为100μl
用粘合剂膜密封每个反应板
以高速将每个反应板的中心涡旋3秒
在560g下旋转板30秒。
将反应板放在冷却室中的冰上，直到装载到热循环仪上
将Sty PCR板装载到热循环仪上（阶段3，步骤19-22）
将板传送到主实验室。
确保热循环仪盖子已预热。块应处于室温。
将每个反应板装在热循环仪上。

运行GW5.0/6.0 PCR程序。程序根据您使用的热循环仪而有所不同。这里使用的实例是GeneAmp PCR系统9700，然而另一个方案可以在制造商的说明 GeneAmp ^® PCR系统9700的GW5.0/6.0 PCR程序

温度	时间	循环
94°C	3分钟	1x
94°C	30秒	\|
60°C	45秒	30x
68°C	15秒	\|
68°C	7分钟	1x
4°C	暂停
卷：	100微升

指定最大模式。

运行凝胶（第3阶段，第23-33步）
注意：以下说明适用于运行2％TBE凝胶。为了确保结果一致，从每个PCR中取3μl等分试样。

当GW5.0/6.0 PCR程序完成后，从热循环仪中取出每个板
旋转板在560×g 30秒。
将板置于冰上的冷却室中或保持在4℃
标记三个新鲜的96孔反应板
P1Gel，P2Gel 和 P3Gel。
将3μl2×凝胶加样染料分装到新鲜，标记的PXGel板的A行到D行的每个孔。
使用12通道P20移液管，将3μl的每个PCR产物从3个Sty PCR板转移到PXGel板的相应板，行和孔。实施例：将来自P1板上A行每个孔的每个PCR产物的3μl转移到P1Gel平板上A行的相应孔中。
密封PXGel板。
旋转每个PXGel板的中心，然后在560×g下旋转30秒。
将每个PXGel板的每个孔的总体积加载到2％TBE凝胶上
在120 V下运行凝胶40分钟至1小时。
验证PCR产物分布在〜200 bp到1,100 bp之间（例如下面的凝胶，图1）

图1. PCR产物的实施例在2％TBE琼脂糖凝胶上在120V下运行1小时。平均产物分布在约200至1,100bp之间。

阶段4：Nsp限制酶消化
在此阶段，基因组DNA被Nsp I酶消化。

解冻/将以下试剂放在冰上（约20分钟）：
1. NE缓冲区2
2. BSA
3. 基因组DNA（如果冻存）
4. AccuGENE水
标记以下管，然后根据需要放置在冷却室或冰上：
1. 一条12条标有"挖"的管子
2. 标记为"Dig MM"的2.0ml Eppendorf管
用基因组DNA制备板，如下：
1. 以高速旋转板的中心3秒。
2. 沿560英尺x g 旋转板30秒。
3. 放回冷却室在冰上。
准备试剂（除了酶）如下：
1. 涡旋3次，每次1秒
2. 脉冲旋转3秒。
3. 放置在冷却室中。
预热热循环仪盖，但在室温下离开块。
注意：将NSP I酶保持在-20°C，直到准备使用。

准备Nsp摘要主混合（阶段4，步骤6-13）
将所有试剂和管保持在冰上，通过加入适当体积的来自表4的以下试剂来制备Nsp消化主混合物：
1. AccuGENE水
2. NE缓冲区2
3. BSA
从冷冻机中取出Nsp I酶，立即放入冷却器中。
脉冲旋转酶3秒。
立即将酶添加到主混合物中，然后将剩余的酶放回冷却器中
高速旋转主混合物3次，每次1秒
脉冲旋转3秒。
置于冷却室中。

将任何剩余的酶返回到冰箱
表4. Nsp I消解主混合

试剂	1样本	48份样品（15％额外）
AccuGENE ^®水	11.55微升	637.6微升
NE缓冲区2（10x）	2微升	110.4μl
BSA（100×; 10mg/ml）	0.2μl	11微升
Nsp I（10U /μl）	1微升	55.2μl
总计	14.75微升	814.2微升

将Nsp摘要主混合添加到示例中（第4阶段，第14-21步）

要将Nsp消化主混合物添加到样品中，使用单通道P200移液管，将67μlNsp消化主混合物分装到标记为Dig的条带管的每个管中。
使用12通道P20移液管，在冰上的冷却室中，向每个DNA样品中加入14.75μlNsp消化主混合物。每个孔中的总体积现在为19.75μl

试剂
卷

基因组DNA（50 ng /μl）
5微升

Nsp消化主混合物
14.75微升

总量
19.75微升
用胶膜密封板。
以高速旋转板的中心3秒。
在560分钟f 或30秒下旋转板。
确保热循环仪的盖子已预热。
将板装载到热循环仪上，运行GW5.0/6.0 Digest程序 GW5.0/6.0文摘计划

温度
时间

37°C
120分钟

65℃
20分钟

4°C
暂停
程序完成后，取出版面并以560 x g 旋转30秒。

阶段5：Nsp连接
在此阶段，使用Nsp适配器连接消化的样品。

解冻/将以下试剂放在冰上（约20分钟）：
1. 适配器Nsp I
2. T4 DNA连接酶缓冲液（10x）
3. Nsp消化的样品（如果冷冻）
4. AccuGENE水
标记以下管，然后根据需要放置在冷却室或冰上：
1. 一条12条标有"Lig"的管子
2. 标记为"Lig MM"的2.0ml Eppendorf管
3. 解决方案盆地
按如下方法制备消解样品：
1. 以高速旋转板的中心3秒。
2. 沿560英尺x g 旋转板30秒。
3. 放回冷却室在冰上。
准备试剂：
1. 高速涡旋3次，每次1秒（除了酶）
2. 脉冲旋转3秒。
3. 放置在冷却室中。
预热热循环仪盖，但在室温下离开块。

准备Nsp连接主混合（阶段5，步骤6-12）
将所有试剂和管保持在冰上，通过向2.0ml Eppendorf管中加入基于表5中的体积的以下试剂来制备Nsp连接主混合物。
1. 适配器Nsp
2. T4 DNA连接酶缓冲液（10x）
从冰箱中取出T4 DNA连接酶，立即置于冰箱中冷藏。
脉冲旋转T4 DNA连接酶3秒。
立即将T4 DNA连接酶加入到主混合物中; 然后放回冷却器。
以高速3次，每次1秒旋转主混音。
脉冲旋转3秒。

将主混合物置于冰上。

表5. Nsp I连接主混合

试剂	1样本	48份样品（15％额外）
T4 DNA连接酶缓冲液（10x）	2.5μl	150μl
适配器Nsp I（50μM）	0.75μl	45微升
T4 DNA连接酶（400U /μl）	2微升	120微升
总计	5.25微升	315微升

将Nsp连接主混合添加到反应中（第5阶段，步骤13-25）

要将Nsp连接主混合物添加到样品中，使用单通道P100移液管，并在冰上将25μlNsp连接主混合物等分到条管的每个管。
使用12通道P20移液器，等分5.25微升Nsp连接主混合物在Nsp消化阶段板上的每个反应。每个孔中的总体积现在为25μl

试剂
卷

Nsp消化的DNA
19.75微升

Nsp连接主混合物
5.25微升

总计
25μl
用胶膜密封板。
以高速旋转板的中心3秒。
沿560英尺x g 旋转板30秒。
确保热循环仪盖已预热。
将板载入热循环仪并运行GW5.0/6.0 Ligate程序。
GW5.0/6.0升级程序

温度
时间

16°C

70℃
20分钟

4°C
暂停
当GW5.0/6.0 Ligate程序完成后，取出板并在560 x g下旋转30秒。
将板放在冰上的冷却室中。
稀释每个反应如下：
1. 将10 ml AccuGENE水倒入溶液池。
2. 使用12通道P200移液器，为每个反应添加75μl的水每个孔中的总体积为100μl
  
  试剂
  卷
  
  Nsp连接的DNA
  25μl
  
  AccuGENE水
  75微升
  
  总计
  100微升
用胶膜密封板。
以高速旋转板的中心3秒。
沿560英尺x g 旋转板30秒。
注意：在PCR之前，用AccuGENE水稀释连接的DNA是至关重要的

阶段6：Nsp PCR
在此阶段，您将等量的每个Nsp连接的样品转移到四个新鲜的96孔板中; 准备Nsp PCR主混合物，并将其加入每个样品; 将每个板放在热循环仪上并运行GW6.0 PCR程序; 并通过在2％TBE凝胶或E-Gel 962％琼脂糖凝胶上运行3μl每种PCR产物来确认PCR。

解冻/将以下试剂放在冰上（约20分钟）：
1. TITANIUM Taq PCR Buffer
2. dNTPs
3. PCR引物002
4. AccuGENE水
5. Nsp结合的样品（如果冷冻）
6. GC-Melt
7. 解决方案盆地
标记以下管，然后根据需要放置在冷却室或冰上：
1. 标记为"P1"，"P2"，"P3"，"P4"的四个96孔反应板
2. 一个标记为"PCR MM"的50ml Falcon管
在冰上放置5个板和1个冷却器的足够的冷却室