材料和试剂

玻璃盖玻片（Ø13mm厚，1号，5号）（VWR国际，目录号：631-0150）
一级抗体（Abs）
1. 小鼠抗Nlrp3（1/100）（Adipogen International，目录号：AG-20B-0014）
  注意：小鼠抗Nlrp3的起始浓度为1μg/μl。
2. 兔anri-IRF4（1/100）（Novus Biologicals，目录号：NBP1-00893）
  注意：兔子anri-IRF4的起始浓度为0.08μg/μl
Duolink ^®试剂
1. 抗兔PLUS探针（1/5）（Sigma-Aldrich，目录号：Duo92002）
2. 抗小鼠MINUS探针（1/5）（Sigma-Aldrich，目录号：Duo92004）
3. 连接试剂（5x）（Sigma-Aldrich，目录号：Duo92007）
  注意：连接试剂，连接酶和扩增试剂都包含在包装＃DUO92007中。
4. 连接酶（1单位/μl）（Sigma-Aldrich，目录号：Duo82029）
5. 扩增试剂（含有橙色标记的寡核苷酸）（5x）（Sigma-Aldrich，目录号：Duo92007）
6. 聚合酶（10单位/μl）（Sigma-Aldrich，目录号：Duo82030）
7. 洗涤缓冲液A（Sigma-Aldrich，目录号：Duo82049）
8. 洗涤缓冲液B（Sigma-Aldrich，目录号：Duo82049）
聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P4707）
Triton X-100（0.1％在PBS中）（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
封锁& Abs稀释缓冲液（0.5％BSA的PBS溶液）
含有DAPI（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：P36931）的固定介质
1x PBS（Lonza，目录号：17-516F）
无RNA酶的水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10977035）}
4％甲醛（PFA）（VWR International，目录号：9713.1000）

设备

移液管（1至1000μl）
荧光显微镜（使用DAPI和Cy2或Cy3发射滤光片）（ZEISS，型号：Imager M2）
注意：建议使用目标63x进行T细胞成像。
37℃孵育器
酶冻结块
轨道振动器

软件

图像J

程序

第0天：如先前所述分离和分化Th2和初始T细胞（Bruchard等人，2015）。然后将约10 7个细胞转移到含有盖玻片的12孔皿中，所述盖玻片用100-150μl的聚-L-赖氨酸滴室温处理10分钟。然后通过移液除去赖氨酸，并用1ml PBS洗涤孔。然后将细胞接种并使其在37℃下附着于盖玻片24小时
第1天：请注意，所有程序从1到5在相同的12孔培养皿中进行细胞培养。将T细胞在1ml PBS中简单洗涤2次，通过用移液管除去培养基并用新鲜PBS代替。请注意，盖玻片不得干燥。
使用200μl4％PFA在4℃下10分钟内进行T细胞固定，随后在含有盖玻片的孔中洗涤1ml PBS 1x 2次。
使用200μl0.1％Triton X-100在室温下2分钟，然后用1ml 1×PBS洗涤2次，获得透化。
在室温下20分钟内使用1ml 0.5％BSA的PBS封闭盖玻片
将盖玻片在30至40μl的稀释的一抗（Abs）中在4℃温育过夜（图2）。

图2. PLA程序的盖玻片处理。A.将直径60mm的塑料培养皿用作Abs温育和PLA实验的湿度室。用填充有水的15ml盖获得湿度。在整个过程中使用平头钳来处理盖玻片。 B.从培养皿中取出后，将盖玻片（*）面向下孵育在30μlAbs（†）上。 C.放置在液滴上的盖玻片（*）。从该步骤，关闭陪替氏培养皿并用石蜡膜密封，并在4℃放置过夜。 D.第二天，使用镊子和针从湿度室小心地拾取盖玻片。然后将盖玻片单独放置在面上在装有3ml 1×PBS的6孔板的孔中洗涤步骤注意：对于Duolink产品的温育也重复该程序。与制造商的说明相比，它能够节省Duolink ^®试剂。仔细跟踪所有其他制造商的说明（孵育时间，洗涤步骤和缓冲液...）
第2天：在室温下，在1x PBS中将盖玻片洗涤3次，每次5分钟
PLA实验使用制造商的说明书进行。该程序也可在生物协议网站（Lin等人，2015）上直到步骤9.
使所有样品在室温下在黑暗中干燥
将一滴含有DAPI的封固剂置于每个样品和载玻片之间。将载玻片保持在4℃下短期储存
第3天：使用配有适当过滤器（DAPI：Ex 365，Em：BP 445/50; Duolink spot：Ex：BP 550/25，Em：605/70;图3）的63x物镜的荧光显微镜进行成像程序，。里面的景点核（作为DAPI作为参考）使用Image J及其分析粒子选项卡进行定量。然后将载玻片保存在-20℃下长期储存。

代表数据

图3.TH2细胞中Duolink斑点的重现图像。用我们的方案（Nv：Naïve，Scale bar in yellow：5μm）获得的T细胞图像。 Th2细胞中的红点是Duolink斑点。

笔记

尽可能使用新鲜制备的BSA在PBS中，或过滤准备，如果使用旧的解决方案。如果不考虑这一步骤，沉积物可能出现并干扰斑点检测。

致谢

这项工作得到法国国家研究局管理的法国政府拨款的支持，方案为"Investissements d'Avenir"，参考文献ANR-11-LABX-0021（Lipstic Labex）。 FG团队是"EquipelabéliséeLigue Nationale Contrele癌症»。 V. D.是"poste d'accueil INSERM"的收件人;该协议改编自Fredriksson等人（2007）和Lin等人（2015）的以前的工作。

参考文献

Bruchard，M.，Rebe，C.，Derangere，V.，Togbe，D.，Ryffel，B.，Boidot，R.，Humblin，E.，Hamman，A.，Chalmin，F.，Berger， Chevriaux，A.，Limagne，E.，Apetoh，L.，Vegran，F.and Ghiringhelli，F.（2015）。受体NLRP3是TH2分化的转录调节子。 Nat Immunol 16（8）：859-870。
Fredriksson，S.，Dixon，W.，Ji，H.，Koong，A.C.，Mindrinos，M.and Davis，R.W。（2007）。通过邻近连接进行多重蛋白检测，用于癌症生物标志物验证。/em> 4（4）：327-329。
Lin，M.Z.，Martin，J.L。和Baxter，R.C。（2015）。 Proximity ligation assay（PLA）to detect protein-protein interactions in breast cancer。协议 5（10）：e1479。