材料和试剂

BL21细菌（DE3）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM）
pGEX-4T-1载体（Addgene，目录号：27458001）
GST融合NLRP3蛋白
谷胱甘肽琼脂糖4B（GE Healthcare，目录号：17-0756-01）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T9284）
含有推定的结合序列的双链寡核苷酸（Life Technologies）
DIG凝胶移位试剂盒（Roche Diagnostics，目录号：03353591910）
3-（4-甲氧基螺[1,2] - 二氧杂环丁烷-3,2' - （5'-氯）三环[3.3.1.1 3,7]癸烷-4-基）苯基磷酸二钠（CSPD）（化学发光底物）
注意：它包含在DIG凝胶移位套件中。
DNAse/RNAse游离水（Thermo Fisher Scientific，目录号：11538646）
Tris-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T5941）
绑定缓冲区（参见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
马来酸缓冲液（参见配方）
10x封锁溶液（参见配方）
检测缓冲区（参见配方）

设备

端到端旋转器
PerkinElmer Envision Plate Reader（PerkinElmer Inc.，目录号：2104-0010A）

程序

GST融合NLRP3蛋白以前在BL21细菌中产生。单独的GST用作对照。简言之，使用经典克隆方法将GST-NLRP3序列插入pGEX-4T-1载体中。 BL21根据供应商的说明通过热休克转化。 24小时后，用1％Triton X-100溶液裂解细菌。

第1天
GST-融合蛋白和谷胱甘肽Sepharose 4B珠的结合
1. 将谷胱甘肽琼脂糖4B用5ml结合缓冲液洗涤两次并在室温下以500×g离心5分钟。
2. GST融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖4B纯化。加入在BL21超声处理后获得的3ml细菌裂解物制备的谷胱甘肽琼脂糖4B，最终体积为30ml 结合缓冲液，并在室温下温和温育30分钟搅动。通过分离蛋白/谷胱甘肽Sepharose 4B复合物在室温下以500×g离心5分钟，并用5℃洗涤 ml结合缓冲液。在500×g离心5分钟收集蛋白/谷胱甘肽Sepharose 4B复合物
  DNA标记反应
  NLRP3结合序列（NBS）（5'-TCTGTTTTGGGAGGCAGAGCTTTGTTTCTATG-3'）用洋地黄毒苷通过使用DIG凝胶移位试剂盒，但液体化学发光DNA 也可以使用生物素化的DNA进行下拉测定
3. 将双链寡核苷酸用不含DNAse/RNAse的水稀释至10ng /μl。
4. 将含有100ng双链DNA（10μl）的试管置于冰上并加入4μl标记缓冲液，5mM CoCl 2溶液，0.05mM DIG-ddUTP溶液和200U末端转移酶。通过上下吹吸混合。
5. 将管离心并在37℃下孵育15分钟干块加热器，并在孵育后立即置于冰上
6. 用2μlEDTA终止反应
7. 然后通过加入3μl水（无DNAse/RNAse）将DNA稀释至4ng /μl
  蛋白质-DNA结合反应
8. 将2μg与谷胱甘肽Sepharose 4B珠结合的GST-蛋白与20fmol DIG标记的双链DNA片段孵育蛋白质-DNA结合缓冲液从DIG Gel Shift Kit在最终体积的20μl在室温下过夜
第2天
1. 用1ml将与DNA结合的GST融合蛋白洗涤3次洗涤缓冲液，并在500×g下每次离心5分钟 min。
2. 然后将珠子在500μl中温育 1x封闭溶液（在马来酸中稀释10倍封闭溶液缓冲液）在室温下处理30分钟
3. GST融合蛋白结合与与75缀合的抗DIG Fab片段一起孵育 mU/ml碱性磷酸酶（来自DIG凝胶试剂盒）在室温下30分钟温度在1x封闭溶液中
4. 与DNA结合的GST-融合蛋白用5ml洗涤缓冲液洗涤两次
5. 洗涤后，将复合物转移到检测缓冲液中 96孔板中，并在室温下与1℃孵育5分钟 μg/ml 3-（4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2' - （5'-氯）三环 [3.3.1.1] 3,7]癸烷} -4-基）苯基磷酸酯（CSPD），随后在37℃孵育10分钟
6. 使用PerkinElmer Envision Plate Reader测量光发射。在每孔1秒内进行光检测。

代表数据

来自所有混合在一起而没有DNA-DIG的试剂的发射信号用于标准化，数据以任意单位表示。所有实验条件用单独的GST-NLRP3和GST测试。单独测试不带DIG标记的双链DNA，并用作竞争剂（图2）

图2.液体化学发光DNA下拉测定的代表性数据。从液体化学发光DNA下拉测定中测量光发射，以指示结合。直方图指示相对光发射（arbritary units，AU）。谷胱甘肽-S-转移酶（GST）-NLRP3与洋地黄毒苷（DIG）标记的NBS一起温育，有或没有竞争剂（未标记的NBS）。数据显示为平均值±sem。

食谱

绑定缓冲区
75 mM KCl
50mM NaCl 1mM EDTA
1 mM DTT
10％甘油 0.1％Triton X-100
洗涤缓冲液
0.1M马来酸
0.15 M NaCl（pH 7.5）
0.3％（v/v）吐温20
马来酸缓冲液
0.1M马来酸
0.15 M NaCl
用NaOH调节至pH7.5
10x封闭溶液
10％（w/v）封闭剂在马来酸缓冲液中
检测缓冲区
0.1M Tris-HCl
0.1 M NaCl（pH 9.5）

致谢

该协议改编自Toshiharu等人（2008）。该项目得到了法国国家研究机构（"Investissements d'Avenir"方案; ANR-11-LABX-0021），国家癌症研究所（FG和FV），国家癌症研究所 pour la RechercheMédicale（F. G）。

参考文献

Bruchard，M.，Rebe，C.，Derangere，V.，Togbe，D.，Ryffel，B.，Boidot，R.，Humblin，E.，Hamman，A.，Chalmin，F.，Berger， Chevriaux，A.，Limagne，E.，Apetoh，L.，Vegran，F.and Ghiringhelli，F.（2015）。受体NLRP3是TH2分化的转录调节子。 Nat Immunol 16（8）：859-870。
Iwasaki，T.，Miyazaki，W.，Rokutanda，N.and Koibuchi，N。（2008）。液体化学发光DNA拉下测定法，以测量溶液中的核受体-DNA结合。 Biotechniques 45（4）：445-448。