材料和试剂

0.6微米金微载体（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-2262）或0.25微米金纳米颗粒（BBI Solutions，目录号：EMGC250）
细胞培养皿，90mm×20mm聚苯乙烯（AGC TECHNO GLASS CO。，目录号：SH90-20）
50ml培养管（Thomas Scientific，Labcon，目录号：3181-345-008）
1.5ml微量管（BMbio，目录号：BM-15）
Parafilm（VWR International，Bemis，目录号：PM996）
微孔手术胶带（3M，目录号：1530-0）
定性滤纸No.2（Toyo Roshi Kaisha，Advantec，目录号：00021110）
转化体培养用试管（AGC TECHNO GLASS CO。，目录号：TST-SCR16-150）
pSA0104矢量
物种：Heterothallic c。复合菌株[NIES-67（mt ⁺）和NIES-68（mt ^-）（国家环境研究所） >
KOD-plus NEO DNA聚合酶（TOYOBO CO。，目录号：KOD-401）
KOD-FX DNA聚合酶（TOYOBO CO。，目录号：KFX-101）
GENEART无缝克隆和装配试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：A13288）
高纯质粒分离试剂盒（Roche Diagnostics，目录号：11754785001）
亚精胺（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-13831）
琼脂粉（Nacalai tesque，目录号：01028-85）
乙醇绝对（Wako Pure Chemical Industries，目录号：057-00451）
甘油（Wako Pure Chemical Industries，目录号：075-00616）
Quant-iT dsDNA测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：Q-33130）
潮霉素B（Wako Pure Chemical Industries，目录号：085-06153）
QuickExtract植物DNA提取溶液（Epicentre，目录号：QEP80705）
四水合硝酸钙[Ca（NO 3）2 sub] 4H 4H 2 O]（Wako Pure Chemical Industries，目录 number：039-00735）
硝酸钾（KNO 3）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：160-04035）
β-磷酸甘油五水合物二钠（Sigma-Aldrich，目录号：50020-1000G）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O 7H 2 O）（Nacalai tesque，目录号：21003-75）
维生素B 12（Wako Pure Chemical Industries，目录号：226-00343）
生物素（Wako Pure Chemical Industries，目录号：023-08711）
硫胺HCl（Wako Pure Chemical Industries，目录号：201-00852）
2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：011-16381）
盐酸（HCl）（Nacalai tesque，目录号：18321-05）
（和光纯药工业公司，目录号：345-01865）。< br /></sup>
氯化铁（III）六水合物（FeCl 3·6H 2 O）6H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：091-00872）
（Nacalai tesque，目录号：21211-45）的氯化锰（II）四水合物（MnCl 2 4H 2 O）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O·7H 2 O）（Nacalai tesque，目录号：37011-62）
（Wako Pure Chemical Industries，目录号：003-00368）。
（Wako Pure Chemical Industries，目录号：019-00247）的Na 2 SO 4，Na 2 SO 4，Na 2 SO 4， br />
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2·2H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：039-00431）
C介质（见配方）
PIV金属（参见配方）
条件C培养基（见配方）
MI培养基（见配方）

设备

300毫升锥形烧瓶（AGC TECHNO GLASS CO。，目录号：4980FK300）
生长室（Nippon Medical& Chemical Instruments，型号：KCLP-1400II CT），中断
手工血球计（1 x 1 mm，网格长度x网格宽度）（不可商购）
热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM，型号：veriti200）
离心机（Hitachi Ltd.，型号：CF16RX）
摆动转子（Hitachi Ltd.，型号：T5SS31）
角转子（Hitachi Ltd.，型号：T15AP31）
离心机（久保田公司，型号：1920），中断了
角转子（久保田公司，型号：RA-48J），中断了
可爱的调音台（EYELA，型号：CM-1000）
Qubit荧光计（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：Q32857），被中断
超声清洁剂（Sigma-Aldrich，Branson ，型号：3510J-DTH）
基因转移系统（田中公司，型号：IDERA GIE-III）
荧光立体显微镜LEICA MZ16 F（Leica Microsystems）
Micro Pick and Place System（Nepa Gene Co.，目录号：MPP-300）
光显微镜（Olympus，型号：CK-40），中断了

程序

转化用细胞的制备
1. 在150ml C培养基中培养营养细胞（ http://www.nies.go.jp/biology/mcc/home。 htm ）在23℃下在16小时光照下（28μmol/m 2 s/s）和8小时暗循环在300ml锥形瓶中。
2. 收集C. psl。复杂细胞从中对数到早固定相（培养9-11天）在50ml培养管中通过离心浓缩（1,100×g，在23℃下2分钟），使用a 摆动式转子（T5SS31）。对于减速，应设置减速度到最慢的速度。
3. 重悬细胞在一小部分新鲜C培养基并在光学显微镜下计数细胞（CK40）使用手工血细胞计数器。调节至5×10 6个细胞的密度 ml ^-1。
4. 传播细胞悬液（1 x 10 细胞）使用玻璃细菌涂布器涂布在90mm板上含有1.5％琼脂（w/v）的C培养基，一天前制备并在室温下储存
5. 在23℃下在10μmolm -2 s -1 ^{-1的连续光下培养细胞2天（图1）。
  
  图1.通过离心沉淀的金颗粒的照片}
制备用于转化C的构建体。 psl。复杂（约4-5天）
1. 为了避免脱靶沉默，用于反义的DNA区域表达应仔细检查，使用BLASTN程序，针对未发表的RNAseq和C的基因组数据库。 psl。复杂
2. 用KOD-plus-NEO通过PCR扩增靶DNA的所需区域 DNA聚合酶（在94℃2分钟，然后30分钟） 98℃下10秒和68℃下1分钟/kbp的循环）。在 CpRLK1 基因的情况下，编码CpRLK1的细胞外结构域的2180bp片段蛋白质。引物DNA应包括额外的序列对应于载体序列 5'-ccagcatgactagtctcgagTTCGGGCTGTTGCTTCGGCGTCA-3'和 5'-gcttcatcaaattactcgagTGGGTGCCGCCGTAGGTTAATAT-3'），这是必需的用于克隆到pSA0104载体中（图2，Hirano等人，2015）使用GENEART试剂盒。试剂盒提供的酶混合物识别并组装载体和PCR片段共享终端末端同源性。 pSA0104载体含有用于靶基因表达的CpHSP70（ 5'CpHSP70 ）的启动子区域和潮霉素抗性基因（ aph7"，Berthold等人，2002）进行选择（图2）。
  A
  
  B
  
  图2.用于转化C的质粒载体。 psl。复杂。 pSA0104和pSA0104_anti- GeneA的构建体。启动子和 CpCAB1 和 CpHSP70 基因的非翻译区显示为浅灰色和白盒子。 aph7''基因（潮霉素抗性基因）用黑框表示。正向和反向引物用于质粒构建如框下方的箭头所示。引发密码子（ATG）和终止密码子（TAA）框。构建体的质粒主链是pBluescript II SK +。， N ， NotI ; X ， XhoI 。 B.pSA0104的序列。限制已经突出了用于克隆和线性化的位点。蓝色字符表示CpCAB1的启动子和非翻译区。粉红色字符表示 aph7''基因。
3. 使用 GENEART试剂盒，插入扩增的DNA片段对应的靶基因的反义链插入pSA0104载体的 Xho I位点（紧接在pCpHSP70 之后）。
4. 确认后序列，从E制备足够量的质粒DNA。使用高纯质粒分离试剂盒或标准品的大肠杆菌培养物碱性SDS法，随后苯酚/氯仿纯化（Birnboim和Doly，1979）
5. 使用Qubit荧光计和Quant-iT dsDNA测定试剂盒精确定量DNA浓度
6. 为了线性化构建体，使用消化载体臂区合适的限制酶，根据制造商的指令。在大多数情况下，不是我， Kpn 我或 sca 我（在pBluescript II SK + 可以使用（图2）。
微载体原液制备
1. 向1.5ml微量管中加入60mg金颗粒和1ml 70％（w/v）乙醇溶液。
  注意：0.25μm的金颗粒将导致更高的转变功效比0.6μm（Abe等人，2008），然而，这可能是昂贵。通常使用0.6μm的金颗粒。
2. 使用微混合器在2,000rpm下涡旋5分钟
3. 允许在室温下沉淀15分钟。
4. 通过使用T18AP31转子在18,800×g下离心10秒进一步沉淀。
5. 用移液管小心取出溶液。
6. 加入1ml无菌MilliQ水并涡旋2分钟。沉积物如步骤B4中那样离心。丢弃水。重复3次。
7. 加入1ml 50％无菌甘油溶液并涡旋1分钟
8. 储存于-20°C直至需要
用质粒DNA包被微载体
1. 解冻微载体（步骤C8），并使用超声波清洗机（设置模式"sonics"）通过超声处理5分钟悬浮。
2. 将以下试剂加入82.5μl（4.95mg，20次）微载体悬浮液在1.5ml微管中。通过短暂涡旋混合加入每种试剂后。
  1. 82.5μl线性化构建体（对于400ng /μl的空pSA0104，其长度为6,086bp）。根据尺寸将浓度调节至相等的摩尔值的结构。
  2. 250μl2.5M CaCl 2（无菌过滤）
  3. 100μl的0.1M亚精胺（无菌过滤）
3. 涡旋2分钟。
4. 在室温下孵育30分钟。每10分钟轻轻颠倒管。
5. 使用Kubota 1920离心机以8,300×g离心10秒（RA-48J转子）沉淀沉淀物。
6. 丢弃上清液，不影响微载体沉淀
7. 加入750μl的70％（v/v）乙醇并涡旋2分钟
8. 沉淀并弃去上清液，如步骤D5-6。
9. 加入750μl无水乙醇并涡旋2分钟
10. 沉淀并弃去上清液，如步骤D5-6。
11. 加入250μl无水乙醇。用石蜡膜密封帽以最小化乙醇蒸发直到需要。
粒子轰击
注意：该方案针对IDERA GIE-III基因转移系统进行了优化（图3）。如果使用其他颗粒输送系统，可能需要进一步优化

图3. IDERA GIE-III基因转移系统的照片
1. 准备高压灭菌顶部琼脂溶液[0.4％（w/v）琼脂的C培养基] 并在42℃的水浴中孵育熔化的琼脂溶液。
2. 将一个耐压室放在一个干净的工作台上（图4）
  
  图4.清洁工作台上的耐压室照片
3. 通过涡旋使微载体完全悬浮（步骤D11）
4. 在高压灭菌的DNA试剂盒的三个孔（图5）的每一个中加入3.3μl微载体悬浮液注意：在添加暂停之前，我们建议您轰炸空墨盒清空盘子。此步骤清洁并防止堵塞的井。
  
  图5.集中在三个孔上的DNA盒的照片。箭头表示油井。
5. 放置DNA试剂盒并预培养。在培养皿（步骤A5，图6）上进入培养皿（图7）。
  
  图6.在含有含1.5％琼脂（w/v）的C培养基的90-mm平板上培养2天的Closterium细胞的照片。
  
  图7.正好在baro托管室前的照片箭头表示DNA弹夹，箭头指示培养板
6. 使用以下参数开始轰击（图8）：
  
  枪至目标距离
  13.0厘米
  
  氦出口压力
  5.5 kgf/cm 2
  在耐压容器中真空
  710-715 mmHg
  
  气阀打开时间允许氦气快速流动
  0.05秒
  
  图8.关注参数的IDERA GIE-III的照片
选择潮霉素抗性细胞
1. 轰击后立即加入5ml熔化的顶层琼脂（步骤E1），并放置30分钟。
2. 加入4毫升C培养基的琼脂板。使用密封板并在23℃下在连续光下孵育2天 μmolm -2 -2 s -1 sup -1），以使得氨基糖苷类磷酸转移酶（aph"蛋白）
3. 通过倾析小心地丢弃琼脂上的C培养基。不要打扰琼脂的顶部表面。
4. 向平板中加入5ml含有50-100μg/ml抗潮霉素B的C培养基，以选择潮霉素抗性菌落。
  注意：用于筛选的潮霉素B的合适浓度在转化之前测试，因为这取决于使用的菌株。在我们的经验，较低的浓度（10μg/ml ）适合选择对于某些C.psl。复杂菌株。
5. 孵育细胞3 至5周，每周更换新鲜。含潮霉素介质，在23℃的连续光照下
6. 选择幸存的菌落（图9），并且在含有0.8％（w/v）琼脂平板上划线条件C培养基（Abe等人，2011）和潮霉素。未知细胞增殖的因子，其由生长的细胞分泌进入包围的环境中，将包括在条件培养基中并且将促进细胞分裂注意：使用立体显微镜检查菌落的污染细菌和/或真菌（图10）。如果发生污染，请清洗通过毛细管洗涤法重复（至少三次）菌落（Andersen和Kawachi，2005）或使用Micro分离单个细胞选择和放置系统。
  
  图9.存活菌落的照片箭头表示存活的菌落在含有50μg/ml潮霉素B的C培养基中温育5 周。
  
  图10.受污染菌落的照片。比例尺= 200μM
7. 选择平板上的单个菌落（步骤F6），并转移至5ml 的条件培养基。在23℃下孵育16小时光和8小时黑暗周期2-3周注意：如果发生污染，则需要按照步骤F6的注释中描述的清洗和隔离单个单元。
8. 将来自步骤F7的增殖细胞转移到新鲜C培养基中并在正常条件下保持（步骤A1）。
确认构建体成功整合到基因组中
1. 根据制造商的说明，使用QuickExtract Plant Extraction Solution从细胞中分离粗基因组DNA
2. 通过PCR用KOD FX从基因组DNA扩增整合的DNA DNA聚合酶（94℃2分钟，然后94℃15秒，98℃）和68℃下1分钟/kbp）。
击倒效应的评价
1. 如果正在使用针对靶蛋白的特异性抗体，则通过Western印迹检查蛋白表达水平。
2. 选择那些显示蛋白质高度降低的转化体表达水平进一步表征，因为敲除效果将不同，并且一些不会显示蛋白质的明显减少表达式
3. 评估所选基因敲低的表型转化体。在我们的情况下，转化子在心肌梗死的性反应大多数评价培养基。

食谱

C介质
5升C介质的储存溶液

10％（w/v）Ca（NO 3）2 sub缓冲溶液	7.5 ml
5％（w/v）KNO 3溶液	10 ml
5％（w/v）β-甘油磷酸五钠水溶液	5 ml
4％（w/v）MgSO 4溶液	5 ml
0.0001％（w/v）维生素B 12溶液	0.5 ml
0.0001％（w/v）生物素溶液	0.5 ml
0.0112％（w/v）硫胺素HCl溶液	0.45 ml
PIV金属	15 ml
2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇	2.5克

用HCl
调节pH至7.5 一个。 PIV金属
组分（500ml）

Na EDTA ^。 2H 2	500毫克
FeCl 3 ^。 6H <2> O	98 mg
MnCl 2 ^。 4H O	18 mg
ZnSO 4 。 7H O	11 mg
COCl <2> ^。 6H <2> O	2 mg
Na 2 MoO 4 sub 。 2H 2	1.25 mg

条件C培养基（Abe et al。，2011）
在新鲜C培养基中孵育野生型mt ⁺或mt ^-细胞14-20天
通过使用定性滤纸过滤收集培养基并通过高压灭菌（121℃15分钟）对过滤的培养基灭菌

MI介质
5升MI培养基的库存溶液

5％（w/v）CaCl 2溶液。 2H 2 O溶液	10 ml
5％（w/v）β-甘油磷酸五钠水溶液	5 ml
4％（w/v）MgSO 4溶液	5 ml
0.0001％（w/v）维生素B 12溶液	0.5 ml
0.0001％（w/v）生物素溶液	0.5 ml
0.0112％（w/v）硫胺素HCl溶液	0.45 ml
PIV金属	15 ml
2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇	2.5克

用HCl
调节pH至8.5

致谢

作者感谢Kensuke Ichihara博士（东京大学）和Wakana Takiguchi女士（JWU）的技术支持。这项工作得到了日本促进协会的部分支持（科学研究助学金（No。）24370038,24247042,25304012,26650147,15H05237到HS，No.23770277到JA，No.23770093和26440223到YT）日本科学基金会，新技术开发基金会给HS和YT的资助，以及MEXT支持的私立大学战略研究基金项目

参考文献

Abe，J.，Hiwatashi，Y.，Ito，M.，Hasebe，M。和Sekimoto，H。（2008）。在内源性HSP70和CAB启动子控制下的外源基因在Cloacerium peracerosum-strigosum-littorale中的表达复合物。植物细胞生理学 49（4）：625-632
Abe，J.，Hori，S.，Tsuchikane，Y.，Kitao，N.，Kato，M。和Sekimoto，H。稳定的核转变的Closterium peracerosum-strigosum-littorale复杂。植物Cell Physiol 52（9）：1676-1685。
Andersen，R.A。和Kawachi，M。（2005）第6章：Traditional microalgae isolation techniques，In：Andersen R.A。（ed）。 <藻类培养技术。 Elsevier Academic Press，pp 83-100（共578页）。
Berthold，P.，Schmitt，R。和Mages，W。（2002）。工程化的链霉菌属 hygroscopicu s aph 7 "基因介导对莱茵衣藻中潮霉素B的显性抗性。 153（4）：401-412。
Birnboim，H.C.and Doly，J。（1979）。用于筛选重组质粒DNA的快速碱性提取程序核酸研究 7（6）：1513-1523
Hirano，N。，Marukawa，Y.，Abe，J.，Hashiba，S.，Ichikawa，M.，Tanabe，Y.，Ito，M.，Nishii，I.，Tsuchikane，Y.and Sekimoto， 2015）。与高等植物的细胞壁传感器相关的受体样激酶是有性生殖需要的植物细胞生理学56（7）：1456-1462。单核细胞藻类