材料和试剂

设备

程序

培养物（5ml）。 Stutzeri RCH2在30℃下在补充有20mM富马酸盐作为碳源，20mM硝酸盐作为电子受体的M9盐和0.5g/L酵母提取物的Hungate管中摇动（250rpm）厌氧生长，。通过在4℃下离心（在5,000xg下10分钟），在对数后期（OD <650> 0.7-0.9）期间收获细胞，并用预冷冻的（4℃） ℃）50mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中，然后以约3-7×10 9个细胞/ml重悬于相同缓冲液中。
在培养管中，将500μl细胞悬浮液加入4.5ml测定缓冲液中。将测定在30℃下在缓慢摇动（150rpm）下在孵育器中温育。可以改变加入的细胞体积以优化反应速度
每5分钟或更长时间取样（100μl）20分钟至1小时，并稀释到900μl蒸馏水中。将1ml Griess试剂加入样品中，并将它们在室温下孵育15分钟温度
测量每个样品在540nm的可见光吸收，并使用在50mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）（0-100μM亚硝酸盐）（图1）中制备的亚硝酸盐标准曲线计算亚硝酸盐浓度。亚硝酸还原酶活性单位催化1nmol亚硝酸盐/分钟的还原。还进行了使用不含细胞的50mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）的阴性对照。

代表数据

图1.0-100μM亚硝酸盐与Griess试剂混合的1：1的标准亚硝酸盐曲线。 A.当将Griess试剂加入含亚硝酸盐的样品中时，产生红 - 粉色。 B.显示的线性标准曲线的值为0-100μM亚硝酸盐。

笔记

如果担心亚硝酸还原酶的氧不稳定性，则该方法可以任选地使用密封的Hungate管进行缺氧，其中顶空与高纯度100％氩交换。 P的亚硝酸还原酶活性。 stutzeri RCH2在氧的存在下在测定的时间段内是稳定的。
除富马酸盐外的其它碳源可用于适应所研究的微生物的碳源优选，包括但不限于乳酸盐，丙酮酸盐和葡萄糖。如果微生物可以发酵所用的碳源而不是依赖于硝酸盐或亚硝酸盐作为电子受体，亚硝酸还原酶可能不会高度表达。此外，细胞在作为电子受体的硝酸盐存在下厌氧生长以增加亚硝酸盐还原酶表达。根据所测定的生物体的耐受性，亚硝酸盐（2-10mM）也可以用作电子受体。

食谱

50mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）
1. 分别制备1M KH 2 PO 4（A）和K 2 HPO 4（B）的1M溶液。
2. 制备含有39％（v/v）溶液A和61％（v/v）溶液B的混合物
3. 在稀释前，用溶液A或B将混合物的pH调节至pH 7.0。
4. 用蒸馏水稀释储备溶液1:20（最终浓度：50mM）。
测定缓冲区
50mM磷酸钾缓冲液（pH7.0） 40mM富马酸盐 1mM亚硝酸盐（pH7.0）

致谢

本材料由ENIGMA（生态系统和网络与基因和分子组装集成）（ http://enigma.lbl.gov ），劳伦斯伯克利国家实验室的科学焦点领域计划，是基于美国能源部，科学办公室，生物和环境研究办公室，合同号DE-AC02-05CH11231支持的工作。

参考文献

Thorersen，MP，Lancaster，WA，Vaccaro，BJ，Poole，FL，Rocha，AM，Mehlhorn，T.，Pettenato，A.，Ray，J.，Waters，RJ，Melnyk，RA，Chakraborty，R.，Hazen， TC，Deutschbauer，AM，Arkin，AP和Adams，MW（2015）。钼的可用性是污染地下水环境中硝酸盐去除的关键。 Appl Environ Microbiol 81（15）：4976-4983。
Zumft，W.G。（1997）。反硝化的细胞生物学和分子基础 Microbiol Mol Biol Rev < （4）：533-616。