材料和试剂

无菌聚丙烯锥形15和50ml管（BD，Falcon ，目录号：352070或等同物）
注意：目前，"Corning，Falcon ^® ，目录号：352070"。
一次性细胞刮刀（Thermo Fisher Scientific，目录号：08-100-241）
无菌螺旋盖微管，2ml（SARSTEDT AG& Co.，目录号：15071353）
无菌，抗气溶胶微量吸头（1-1000μl容量）（Eppendorf AG或同等品）
棉塞 - 无菌血清移液管（1-25ml容量）（Eppendorf AG或等同物）
带有通气盖的直颈聚苯乙烯组织培养瓶，75cm 2（Bioexpress，目录号：T-3001-2）和225cm 2（BD，Falcon ^TM，目录号：353139）
注意：目前，"Corning，Falcon ^® ，目录号：353139"。
具有盖子12（Greiner Bio-One GmbH，目录号：665180）和96（Greiner Bio-One GmbH，目录号：655086）的聚苯乙烯组织培养板
用于移液管助剂的0.22μm过滤器（VWR International，目录号：28145-481）
真空驱动的Stericup 500ml Millipore ExpressPLUS0.22μmPES（Merck Millipore Corporation，型号：SCGPU05RE）
超离心管
1. Ultra-Clear TM离心管，14×89mm（Beckman Coulter，目录号：344059）
2. Ultra-Clear TM离心管，25×89mm（Beckman Coulter，目录号：344058）v
HEp2细胞（ATCC，目录号：CCL-23）
人RSV株A2（ATCC，目录号：VR-1540）
支原体清除剂（MP BioMedical，目录号：093050044-5ml）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Techology，目录号：11995073）
注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM ，目录号：11995073"。
UltraPure TM EDTA（0.5M）（Gibco，目录号：15575）注意：目前，"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM ，目录号：15575"。
胰蛋白酶-EDTA，0.25％（重量/体积）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25300054）}
胎牛血清（FBS），在56℃热灭活30分钟（Thermo Fisher Scientific，目录号：10082-147）
注意：等分试样应储存在-20°C下，并在使用前解冻。
庆大霉素试剂溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15750-060）
丙酮酸钠溶液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：11360070）}
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：25030-081）
Hanks平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14025-092）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10010056）
乙醇（Thermo Fisher Scientific，Decon ，目录号：64-17-5）
甲醇（HPLC）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：A452）
结晶紫（Thermo Fisher Scientific，目录号：C581）
干冰
Thermo Scientific GeneRuler ^TM 100bp Plus DNA Ladder 100至3,000bp（Thermo Fisher Scientific，目录号：FERSM0322）
电泳，加样染料，Thermo Scientific，6x DNA加载染料（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：R0611）
UltraPure琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：16500-500）}
Tris-acetate-EDTA（TAE），10x（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15558026）}
D-蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：BP220）注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，目录号：BP220"。
明胶，来自牛皮肤（Sigma-Aldrich，目录号：G9391）
Superscript III第一链合成系统（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：18080-051）
Platinum Taq DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：10966018）
TRIzol试剂（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：15596018）
dNTP集（100mM）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：10297117）
Pierce 考马斯加（Bradford）蛋白质测定（Thermo Fisher Scientific，目录号：23236）
RT-PCR引物
1. DI1引物：5'-CTTAGGTAAGGATATGTAGATTCTACC-3'
2. gRSV/DI引物：5'-CCTCCAAGATTAAAATGATAACTTTAGG-3'
常规组织培养基（TCM）（参见配方）
感染介质（见配方）
PNE缓冲区（参见配方）
20％蔗糖（见配方）
0.1％PBS中的明胶（参见配方）
1％结晶紫储备溶液（见配方）
水晶紫工作液（见配方）

设备

II类生物安全柜
批准的BSL-2或增强的BSL-2实验室设施
个人防护装备（PPE）
用于70％（vol/vol）乙醇的喷雾瓶
微量移液器（1-1000μl容量），多通道移液器（1-200μl容量）
移液器控制器（VWR International）
涡旋混合器（Thermo Fisher Scientific）
水浴，37℃（Thermo Fisher Scientific）
冷冻台式离心机（15ml和50ml锥形管）（Eppendoff AG，型号：5810R）
Optima TM sup- L-90K超速离心机（Beckman Coulter，目录号：365670）
SW 32 Ti转子包，摆动斗（适用于25 x 89 mm管）（Beckman Coulter，目录号：369694）
SW 41 Ti转子包，摆动斗（适合14 x 89 mm管）（Beckman Coulter，目录号：331362）
Gradient Master（BioComp Instruments Inc.，目录号：107-201M）
冷冻箱和冰箱：-80°C，-20°C和4°C
组织培养孵育器（37℃，5-7％CO 2）（Thermo Fisher Scientific）
单元格计数器
细胞培养显微镜（尼康公司或同等产品）
微波
玻璃锥形烧瓶（500ml）
琼脂糖凝胶浇铸托盘（Thermo Fisher Scientific）
电泳室（Thermo Fisher Scientific）
电源（Thermo Fisher Scientific）
紫外灯箱（Thermo Fisher Scientific）
Gel DocTM XR +凝胶成像系统（Bio-Rad Laboratories）
NanoDrop 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）
Variokan ^TM Flash多模式读取器（Thermo Fisher Scientific）

程序

制备具有低含量病毒性粒子（RSV-LD）的RSV种子原料
注意：此步骤旨在扩增从ATCC购买的原始病毒。目标是有足够的材料，然后生成RSV-HD股票。
1. 对于病毒的初始扩增，种子为5×10 5个/孔无支原体HEp2细胞在TCM中在一个6孔板的前一天病毒感染。
  注意：本协议中的细胞和病毒感染在37℃，7％CO 2下的组织培养培养箱中孵育（5％CO > 2 可以也可以使用）。
2. 第二天，用无菌PBS洗涤细胞两次并以0.01组织培养感染剂量的MOI感染RSV （TCID <50>）/小区。使用种子数量的单元格进行MOI计算。在感染培养基中稀释病毒，使用总体积200μl每次感染。在组织培养箱中37℃孵育2小时。
3. 每15-20分钟摇动平板一次，以保持病毒均匀分布，避免细胞干燥。
4. 孵育2小时后，每孔加入2ml感染培养基（见Recipes），并在组织培养箱中孵育。
5. 通过刮除细胞并与培养物上清液一起收集，在感染后5天收获病毒。
6. 离心收集的细胞和上清液在280×g进行5分钟在4℃的台式离心机和分离上清离开约。 200μl上清液在具有沉淀的细胞的管中
7. 用剩余的200μl上清液重悬细胞沉淀在干冰/乙醇中快速冷冻混合物，然后快速解冻37℃水浴。重复此快速冻/融步骤至少3次并每次涡旋。
8. 池所有冻融细胞碎片与保存的上清液，涡旋混合好，等分（500 μl/管），并在干冰/乙醇中快速冷冻病毒。这是Passage 1病毒（P1）。
9. 第二次扩增该P1病毒（P2）。
10. 对于P2扩增，在一个T-75烧瓶中种子3×10 6个HEp2细胞，感染用1ml感染培养基稀释的200μlP1病毒与P1相同。在组织培养物中孵育2小时后培养箱中向每个烧瓶中加入9ml感染培养基
11. 如P1所述，感染后5天收获病毒。等分试样（100μl/瓶）并快速冷冻病毒。
12. 滴定P2（含有上清液和碎片）之前继续进行RSV-HD制备（滴定方法参见 TCID <50> 部分）。
  注意：细胞死亡应注意4-5天感染后（图1）。如果注意到更早的细胞死亡，减少 P1病毒的量。如果在感染5天后没有注意到细胞死亡，在步骤A10-12之后的另一次通过P2。
  
  图1.细胞死亡在RSV感染期间。 HEp2细胞用RSV感染，MOI为0.1。感染后4天拍摄图像。左：模拟感染。右：RSV-LD感染。比例尺：0.1mm
制备和浓缩具有高含量的缺陷病毒颗粒（RSV-HD）的RSV原液。
注意：此步骤旨在丰富RSV股票中的DVG。目标是具有足够的含有DVG的缺陷病毒颗粒以从病毒原液中纯化。在病毒感染期间促进DVG产生的标准方法是使病毒原液（从A部分在体外使用高MOI产生）顺序通过。
1. 为了制备RSV-HD种子原液，用RSV-LD P2在a。感染HEp2细胞 moi为4 TCID 50 /细胞，两次传代以产生RSV-HD P1和P2。使用与LD制备相同的程序。具体来说，T75烧瓶是用于用1ml /瓶的接种物进行RSV-HD P1和P2扩增。在2小时后应加入额外的9ml感染培养基孵化。使用TCID 50测定法计算病毒滴度（参见， TCID <50>部分）。
2. 收获病毒2天后感染或何时一半以上的细胞死亡。快速冻/融细胞沉淀至少3次，如步骤A6-7中所述。
3. 收集上清液并弃去细胞碎片。等分试样（500μl/瓶）并快速冷冻病毒
4. 为了产生RSV-HD工作原种，将10 7个HEp2细胞种在一个中 T-225瓶中，并以10TCID 50 /细胞的moi用RSV-HD P2感染。使用接种物，每个T-225瓶4ml，并遵循感染程序如上所述。加入21 ml感染培养基，孵育2 h后病毒并将其放回组织培养箱中。
5. 二几天后，或当一半以上的细胞已从中分离时板，刮细胞并与培养物一起收集上清液收获病毒。
6. 在4℃下在台式离心机中以280×g离心5分钟并收集上清液。
7. 将2-3ml上清液返回到每个沉淀，并放置其余的上清液。悬浮颗粒，涡旋和快速冷冻/融化混合物至少3-4次，如步骤A6-7。
8. 在台式离心机中以280 x g离心5分钟，目标是以消除碎片。取上清液并将其与剩余的上清液。
  警告：在此步骤丢弃碎片。
9. 在4℃下以59,000×g超速离心上清液2.5小时使用SW 32 Ti转子和Ultra-Clear ^TM 25×89mm离心管集中RSV-HD工作库存
10. 用1ml HBSS轻轻洗涤两次，不影响沉淀
11. 将沉淀悬浮在总共200μl的感染培养基/T225烧瓶中。
12. 等分试样（200μl/小瓶）并且在干冰/乙醇中快速冷冻病毒用于储存。
13. 为了获得足够的有缺陷的病毒颗粒，我们通常感染48个T225-烧瓶，共9ml的超离心RSV-HD（更少病毒可能是足够的，但产量降低）。
RSV缺陷病毒颗粒的纯化
注意：此步骤旨在将具有DVG的缺陷病毒颗粒与具有全长基因组的感染性病毒颗粒分离。由于缺陷病毒颗粒比标准病毒颗粒小得多且密度较小，所以较轻（在我们的情况下是顶部）级分含有最多的DVG。
1. 在生物安全罩中新鲜制备100 ml PNE缓冲液，摇匀并混匀
2. 使用PNE缓冲液制备20％和60％蔗糖溶液，摇动并混匀
3. 设置6支超透明^TM 14 x 89mm离心管。
4. 用5ml 20％蔗糖溶液填充每个管。小心和缓慢吸取5 ml 60％蔗糖溶液，从底部开始并缓慢提起20％蔗糖层注意：慢动作至关重要。应观察到20％至60％蔗糖溶液之间的明显分离。
5. 小心地装载含有蔗糖溶液的管梯度Master产生20％-60％蔗糖梯度。这样做生物安全罩保持无菌
6. 一旦完成，仔细层上1.5ml的超离心RSV-HD（在步骤B中制备）每个蔗糖梯度。使用P1000微量移液管放置病毒。的管应填充距离边缘2-3mm以避免它们在超速离心期间崩解。
  警告：在添加病毒时，请勿打扰蔗糖梯度。
7. 超离心机梯度与病毒分层2小时 116,000xg在4℃下使用SW 41 Ti转子和Ultra-Clear TM sup 14x89mm 离心管
8. 一旦离心机完成，小心删除顶部粉红色层。
  注意：你应该能够观察到几个云层。提取使用P1000微量移液管从顶部到底部的多云层。转让并将来自所有6个管的相同级分合并到单独的清洁超透明14 x 89毫米离心管。总共提取3层从RSV-HD，从上到下命名为部分1，2，3（图2）。
  
  图2.通过蔗糖渐变纯化的缺陷病毒颗粒示意图
9. 使用PBS从顶部填充每个管2-3mm，并使用SW 41 Ti Rotor在4℃下以106,000×g超速离心2小时。
10. 将来自每个级分的沉淀物悬浮在1ml的0.1％明胶中 PBS，等分试样每个小瓶100μl，快速冷冻，并储存在-80℃。
通过TCID <50> （感染性病毒滴度）的病毒滴定
注意：此步骤旨在根据其在允许细胞中复制的能力来量化每种纯化级分中含有的感染性病毒颗粒。
1. 滴定前一天用HEp2细胞制备96孔板。种子该板在TCM中以2×10 4个细胞/孔（100μl/孔的溶液 2×10 6个细胞/10ml TCM）。一个板将适合四个测试样品。根据需要准备多个板。
2. 滴定当天，细胞应该是80-90％汇合
3. 在单独的96孔板中，制备1/10系列稀释的级分1,2和3在感染培养基中一式三份。要做到这一点向板的所有孔中加入90μl感染培养基。加入10μl每个分数到第一行上的每个孔。为每个准备三次分数。为媒体单独留出三行，并包括一个正值用已知滴度的病毒对照。使用多通道移液器混合病毒与感染培养基在第一行转移10微升到下一行。更改提示，混合和传输10μl到下一行，继续直到最后一行。确保混合病毒和改变每次稀释的提示。
4. 取出含有细胞的板的TCM，并用100μl无血清培养基洗涤单层两次。
5. 使用多通道移液器，转移25微升/孔的病毒稀释至细胞并在37℃下在组织培养物中孵育2小时孵化器。开始从板的底部（更高稀释），以避免从较高浓度携带病毒
6. 每孔加入75μl的感染培养基，在a中孵育4-5天组织培养孵化器。小心不要弄脏介质病毒从板。
7. 为了确定病毒滴度，将培养基丢弃在含有10％漂白剂的玻璃托盘中。
8. 向孔中加入100μl结晶紫工作溶液。小心不要触摸井底。
9. 等待15-30分钟。
10. 通过将其倒置在水中几次洗涤板，以消除过量的结晶紫
11. 让它在室温下干燥。
12. 通过确定具有阳性CPE的最后稀释度来评价滴度（图3）。对最后一次稀释的阳性孔数进行分数（三的正数）。从这个分数计算TCID <50> /25μl，其中"x"对应于稀释：
  "+ + +"10 ^x TCID 50 = 10 0.7 /25微升
  "+ + - "10 ^x TCID 50 = 10 0.4 "+ - - " 10 ^x TCID 50 = 10 ^X-0.1/25μl
  
  图3. TCID 50的结晶紫染色。三分之一的效价如上所述通过TCID 50测定不同的病毒。 10 ^-4和10 ^-5是指定病毒的阳性CPE的最后一次稀释样品，其为"x"。 "+"代表观察到的阳性CPE。 " - "表示未观察到CPE。基于上述方程，计算每种病毒的最终滴度如图所示。

估计病毒颗粒总量（总病毒）
注意：此步骤旨在估计每个纯化级分中存在的总病毒颗粒的量。我们使用通过Bradford测定法测量的每个级分中的蛋白质总量作为总病毒的估计

将5μl级分1,2和3稀释到20μldH 2 O单独→1：5稀释物中。

使用如表1所示的系列稀释液制备BSA标准品（试剂盒中提供）。

表1.来自2mg BSA储液的标准曲线的BSA系列稀释

标准号	稀释剂体积（μl）	库存或样品的数量（μl）	BSA浓度。 mg/ml
1	25	75（BSA：2mg/ml）	1.500
2	65	65（BSA：2mg/ml）	1.000
3	35	35 of std 1	0.750
4	65	65 of std 2	0.500
5	65	第4段的第65条	0.250
6	65	第5条第65条	0.125
7	80	20 of std 6	0.025

准备15ml的考马斯蓝试剂（试剂盒中提供） 96孔板，并在使用前平衡至室温。
每孔加入150μl考马斯蓝试剂到96孔板中
加入5μlBSA标准品和稀释的级分1,2和3.
点击板的边缘进行混合。
在室温下孵育平板15分钟。
使用Variokan ^TM Flash多模读取器或等同物读取595 nm的O.D。
基于标准曲线，计算级分1,2和3的总蛋白浓度。

感染性/总病毒蛋白比例计算
注意：此步骤旨在确定哪个部分包含大多数具有最低标准感染性病毒颗粒的缺陷病毒颗粒。
1. 感染滴度（I）和总病毒蛋白（T）之间的比率等于每25μl/总25μg/总病毒蛋白的TCID 50次。
2. 选择具有最低I/T的级分以进一步验证有缺陷的病毒基因组内容。

通过PCR验证纯化的RSV缺陷病毒颗粒
注意：此步骤旨在确认在章节F中选择的部分富含DVG。为此，将允许细胞与每种纯化的级分一起温育，并使用特异性RT-PCR测定（DVG-RT-PCR）鉴定DVG。有关DVG RT-PCR测定的详细说明，请参阅Sun et al。（2015），图S1。

HEp2细胞补充有PBS或1,10,20μl的选择分数。在单独的井感染RSV-HD工作股票作为对照的1的MOI
收获感染细胞10 h后感染加入TRIzol。从TRIzol提取RNA 制造商的协议。通过纳米滴定量RNA浓度并使用1μgRNA进行逆转录（RT）。
混合每个样品在一个管中的以下试剂：1μl的DI1引物（50uM），1μldNTP（10mM），1μgRNA，无核酸酶的H 2 O 2（加起来为10μM） μl）。
在65℃孵育10分钟。
准备RT反应使用SuperScript III逆转录酶在冰上管中混合第一链系统如下（每个样品）：5x RT缓冲液2μl，25mM MgCl 22μl，0.1M DTT2μl，RNase OUT1μl，SS III1μl。
孵育后，向每个样品中加入10μlRT混合物。混合良好。
在50℃孵育50分钟。
在85℃加热5分钟
每个样品加入1μlRNase H（从SuperScript III逆转录酶试剂盒），并在37℃孵育20分钟。
cDNA可以储存在-20℃或直接用于PCR

旋转cDNA并制备如下的DI-PCR混合物：

试剂	体积（μl）
水	13.75
缓冲区（10x）	2.5
MgSO 4（50mM）	2.5
dNTPs（10mM）	2.0
RSV DI1引物（10μM）	1.0
DI gSeV引物（10μM）	1.0
Taq聚合酶（5单位/μl）	0.25
cDNA	2.0
总计	25

在热循环仪中运行PCR程序

程序	温度（℃）	时间
变性	95	10分钟	暂停
变性	95	30秒	33-35个周期
退火	55	30秒
扩展	72	90秒
最后延长	72	5分钟	暂停
	4	∞	暂停

向每个样品中加入4μl加样缓冲液
将样品和100 bp Plus DNA梯子装入1.5％琼脂糖凝胶中
观察缺陷病毒基因组条带，如图4所示。

图4.缺陷病毒基因组和标准基因组的内容部分1.将HEp2细胞与感染培养基一起温育补充有0,1,10或20μl纯化的缺陷型病毒颗粒（pDP）（级分1）。细胞用RSV-HD以MOI感染为1，作为阳性对照。在10小时后收获样品感染。提取RNA，然后进行DVG-RT-PCR以检测DVG（A）和基因组qPCR以定量全长病毒基因组内容（B）。在pDP补充期间观察到的条带反映了模式 RSV-HD感染。标准病毒的小病毒复制在pDP补充期间检测到，证明该级分是富集DVG（但不是基因组）。四个主要乐队进一步通过测序确认[参见Sun等人（2015），图S2]。详情关于RSV基因组qPCR，请参见Tapia等人（2013）。

食谱

常规组织培养基（TCM）
500ml DMEM补充：
10％胎牛血清 1mM丙酮酸钠（终浓度）
2mM L-谷氨酰胺（终浓度）
50mg/ml庆大霉素（最终浓度）
将溶液通过0.22μm过滤器
感染介质
500ml DMEM补充：
2％胎牛血清（终浓度）
1mM丙酮酸钠（终浓度）
2mM L-谷氨酰胺（终浓度）
50mg/ml庆大霉素（最终浓度）
将溶液通过0.22μm过滤器
PNE缓冲区
补充有200μl0.5M EDTA的50ml PBS
20％蔗糖 10g蔗糖溶于最终体积为50ml的PNE缓冲液中 60％蔗糖 30g蔗糖溶解在最终体积为50ml的PNE缓冲液中
0.1％明胶在PBS中
向500ml dH 2 O中的总体积中加入500mg明胶粉，摇动直至完全溶解。
将溶液通过0.22μm过滤器
保持无菌
1％结晶紫储备溶液（100ml） 1克结晶紫
20ml 100％乙醇 80毫升dH 2 O 2 /
水晶紫工作股
40ml 1％结晶紫溶液
80 ml甲醇
180ml dH 2 O

致谢

这项工作是由国家卫生研究所（CBL）授权AI083284支持。本文所述的方案基于以下论文：Sun等人（2015）。

参考文献

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