材料和试剂

火抛光的硼硅酸盐玻璃微量吸移管（世界精密仪器）带有吸气装置（图1D）
1. 聚乙烯管（BD，Intramedic TM，型号：PE＃205）
2. 1 ml注射器（BD）
  注意：移液管尖端必须足够大，以允许味蕾轻松通过开口（60〜80μm和20〜30μm为味蕾和味细胞收集）。然而，一个大开口将导致大体积的溶液被吸入抽吸移液器。
具有解剖针的Sylgard皿（图2A）
Eppendorf离心管（1.5ml）
35mm培养皿（Corning）
注射器的塑料二通阀（图1D）
细胞-TAK细胞和组织粘合剂（Corning）涂布的盖玻片
注意：在12-mm盖玻片的中心涂抹一滴Cell-TAK。等待液滴完全干燥。使用乙醇（75％），然后用纳米UV水冲洗和清洁盖玻片。
C57BL/6J株小鼠（Jackson实验室）（图1A）
100％CO 2
Nanopure UV水（Thermo Fisher Scientific）
胶原酶A（Roche Diagnostics，目录号：10103578001）
Dispase II（Roche Diagnostics，目录号：04942078001）
弹性蛋白酶（Worthington Biochemical Corporation，目录号：2292）
胰蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：10109886001）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C5670）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M4880）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：S6297）
丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：P5280）
D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021）
BAPTA（EMD Millipore Corporation，Calbiochem，目录号：196418）
乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E0396）
酶混合物（见配方）
Tyrode的缓冲区（参见配方）
Ca ^{2 +}/Mg ^{2 +} - 无Tyrode缓冲液（参见配方）

设备

Olympus IX73倒置荧光显微镜（Olympus Imaging America Inc.，Olympus Optical）
立体解剖显微镜（ZEISS，蔡司光学）（图1C）
光纤照明器（Dolan-Jenner Industrial Inc.）
在气缸中压缩CO 2气体（图1B）
塑料室与大长度的乙烯管材连接
XSE分析天平（Mettler-Toledo International Inc.）
单样本微量渗透压计（Advanced Instruments，型号：3320）
Thermo Scientific台式pH计（Thermo Fisher Scientific，Accumet TM，型号：XL15）
Narishige微型锻造钨丝灯丝，电加热（NARISHIGE集团，型号：MF-900）
火焰/棕色玻璃微量移液器（Sutter Instruments，型号：P-1000）
记录/灌注室（Warner Instruments，型号：RC-25）（图2B）
用于RC-25记录室并安装在Olympus IX73显微镜（图2B）上的磁性平台（PH4）
Thermolyne搅拌器（Thomas Scientific，型号：Nuova II）
Spectrafuge 7M微量离心机（ReGen Lab Equipment，型号：SKU：W095074）
Eppendorf 5702离心机（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific ，型号：Eppendorf 5702）
VWR涡旋混合器（VWR International，型号：MINI 230V）
Gilson移液器（200μl和1ml吸头）（VWR International）
镊子
显微外科剪刀

程序

在深CO 2（100％）麻醉下通过颈脱位将小鼠安乐死（图1A-B）。
从动物获得舌头，并放置在Tyrode的缓冲液中
将舌头放在Sylgard盘上，以便可以容易地接近vallate乳头（图1C）
注射约0.3毫升酶混合物在附近乳头乳头（在每一侧）上下区域。针应明显在上皮下。
注意：通过插入针太深来输送酶混合物将导致肌肉组织的消化。如果针的位置太浅，上皮将被刺穿，酶混合物可能通过舌上皮上的孔泄漏。

图1.小鼠的安乐死和损伤的切除。照片显示（A）动物C57BL/6J小鼠，（B）用于安乐死动物的装置，（C）舌头固定在Sylgard皿在立体解剖显微镜下，（D）用于收集味蕾的抽吸装置
在5〜10ml Tyrode缓冲液中通气30分钟，孵育舌头。
重新固定舌头，以便可以容易地接触到乳头乳头（图1C）
用显微外科剪刀剪切围绕vallate乳头的上皮。
使用尖锐的镊子将上皮从舌头剥离。
把上皮片，浆液一面朝上，塞到一个Sylgard菜。拉伸上皮，使每个乳头暴露和容易获得（图2A）。
交换Ca ^{2 +}/Mg ^{2 +} -free Tyrode's缓冲液的溶液。孵育上皮在缓冲液中20分钟收集个别味蕾或30分钟为单味细胞。
用规则Tyrode缓冲液替换Sylgard培养皿中的Ca ^{2 +}/Mg ^{2 +} - 无Tyrode缓冲液。
使用火抛光的玻璃微量移液管（60〜80μm）（图1D），抽吸每个乳头几次。定期停止并将溶液排放到Cell-TAK处理的盖玻片上 < em>关键：通常，在vallate乳头上有足够数量的味蕾来制备2〜4盖玻片。

图2.显示剥离的舌侧上皮，浆液侧朝上，固定在Sylgard盘上。图2.吸引装置设置以收集来自小鼠vallate乳头的味蕾。 B.进行味蕾的分离Sylgard培养皿，然后将味蕾通过玻璃微量移液管递送到装配在平台上的记录室。 C.当在奥林巴斯IX73显微镜下观察时，活体制剂中孤立的味蕾的Nomarski光学显微图像。
为了收集单细胞，需要通过20〜30μm的火抛光玻璃移液管进行温和研磨（将含有味蕾的蒂罗德吸入玻璃移液管并立即将其排出，重复5-6次）。注意：验证完整的膜可以是健康看起来的味蕾/细胞的标准。如果细胞内Ca 2+浓度在其静止阶段超过200nM，则味觉细胞可能不健康（危急！）。
让味蕾和/或味细胞沉淀20分钟，并附着在由玻璃盖玻片制成的室底部（图2B-C）。

食谱

酶混合物
胶原酶A 1mg/ml
Dispase II 2.5mg/ml
弹性蛋白酶1mg/ml
胰蛋白酶抑制剂1mg/ml
Tyrode的缓冲区
310-320 Osm并在pH 7.2下施用 CaCl 2 2mM
HEPES 10mM
KCl 5mM
MgCl 2 1mM
NaCl 140mM
NaHCO 3 3mM，
丙酮酸钠10mM
葡萄糖10 mM
Ca 2+ +/+/Mg 2+ +无缓冲液（pH 7.2）。
CaCl 2 <0mM，
HEPES 10mM
KCl 5mM
MgCl 2 <0mM，
NaCl 140mM
NaHCO 3 3mM，
丙酮酸钠10mM
葡萄糖10 mM
BAPTA 2mM
EGTA 2mM

致谢

这项工作是由SIUSOM研究种子授权（AYH）支持。

参考文献

Finger，T.E.，Danilova，V.，Barrows，J.，Bartel，D.L.，Vigers，A.J.，Stone，L.，Hellekant，G.and Kinnamon，S.C。（2005）。 ATP信号对于从味蕾到味觉神经的交流至关重要。科学 310（5753）：1495-1499。
Huang，A.Y。和Wu，S.Y。（2015）。降钙素基因相关肽降低小鼠味蕾的味觉诱发ATP分泌。 < em> J Neurosci 35（37）：12714-12724。
Huang，Y.J.，Maruyama，Y.，Dvoryanchikov，G.，Pereira，E.，Chaudhari，N。和Roper，S.D。（2007）。 pannexin 1半通道在小鼠味蕾中ATP释放和细胞 - 细胞通讯中的作用。 Proc Natl Acad Sci USA 104（15）：6436-6441。