材料和试剂

HEK293E细胞
质粒和载体
1. HA-Raptor（Addgene，目录号：8513）
2. myc-mTOR（Addgene，目录号：1861）
3. Rheb（国家生物技术信息中心，Gene，目录编号：6009）使用网关克隆系统克隆到pDEST27中根据制造商方案（Life Technologies，目录 number：11812-013）
  注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Invitrogen™，目录号：11812-013"。
4. 如先前所述产生的GST-4E-BP1/pGEX载体（Dunlop等人，2009）
抗体
1. 克隆9E10抗-Myc抗体（Sigma-Aldrich，目录号：M5546）
2. 克隆9B11抗-Myc抗体（Cell Signaling Technology，目录号：2276）
3. 抗HA（Roche Diagnostics，目录号：11867431001）
4. 抗GST（Merck Millipore Corporation，目录号：05-782）
细胞培养和转染
1. Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）
2. 10％胎牛血清（FBS），EU Approved（South American）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10270-106）
3. 青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15070-063）
  注意：将HEK293E细胞在补充有10％FBS，1μg/ml青霉素和1μg/ml链霉素的DMEM中培养。}
胰岛素（Sigma-Aldrich，目录号：I9278）
雷帕霉素（EMD Millipore公司，目录号：553210）
分析级别的化学品
1. HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
2. EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：431788）
3. （二钠盐，五水合物）（Sigma-Aldrich，目录号：50020）
4. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
5. 氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
6. 腺嘌呤三磷酸（ATP）（Sigma-Aldrich，目录号：A26209）
7. 亮肽素（Sigma-Aldrich，目录号：L5793）
8. Antipain（Sigma-Aldrich，目录号：10791）
9. 苯甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：12072）
10. 胃酶抑素A（Sigma-Aldrich，目录号：P5318）
11. 钒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：289361）
12. 二硫苏糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：43815）
13. 苯甲基磺酰氟（Sigma-Aldrich，目录号：78830）
14. 渥曼青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：W1628）
15. 3 - [（3-胆酰氨基丙基）二甲基铵基] -1-丙磺酸盐水合物（CHAPS）（Sigma-Aldrich，目录号：226947）
mTOR裂解缓冲液（参见配方）
低盐mTOR洗涤缓冲液（参见配方）
高盐mTOR洗涤缓冲液（参见配方）
mTOR洗涤缓冲液（参见配方）
3x mTOR激酶测定缓冲液（参见配方）
Rheb裂解缓冲液（参见配方）
Rheb存储缓冲区（参见配方）
磷酸盐缓冲盐水（见配方）
mTOR测定开始缓冲液（参见配方）
蛋白酶抑制剂（参见配方）

设备

热混合器加热块（Eppendorf AG，型号：Eppendorf thermomixer compact）
冷冻迷你离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific™，型号：Heraeus和Fresco 17离心机）
Stuart TM TM SB2固定速度旋转器（Bibby Scientific Limited，Stuart Scientific）

程序

注意：整个过程的概述可以在图1中找到。

图1.mTOR 体外激酶测定如"方法"中所述，制备（A） mTORC1复合物，（B）Rheb-GTP和（D）药物抑制剂（雷帕霉素/FKBP12和渥曼青霉素）和mTORC1底物（4E-BP1）在mTORC1激酶测定（E）中

从HEK293E细胞产生mTOR/raptor复合物
1. HEK293E细胞在Dulbecco改良的Eagle's培养基中培养（DMEM），补充有10％胎牛血清（FBS）和1％，100μg/ml 青霉素和100μg/ml的链霉素
2. 75cm 2烧瓶中的80％汇合的HEK293E细胞用5μgMyc标记的共转染 mTOR和5μgHA标记的Raptor构建体或用a GST标记的Rheb构建体使用磷酸钙转染方法（1×75cm 2的HEK293E细胞的烧瓶对于三种mTOR是足够的激酶测定）。转染后36小时收获细胞。细胞是在裂解前用10μg/ml胰岛素处理30分钟。这个剂量是足以刺激mTORC1信号并确保活性如先前所证实的，纯化复合物（Dunlop等人，2009）
3. 刺激细胞与100 nM胰岛素15分钟，然后在1毫升补充有蛋白酶抑制剂和0.3％CHAPS的mTOR裂解缓冲液（w/v）。
4. 在4℃下，以16,200×g离心8分钟（冷冻迷你离心机）。
5. 孵育溶胞产物与3微升的Myc或HA抗体（mTORC1复杂可以用HA- raptor或myc-mTOR免疫沉淀纯化）在4℃下旋转1.5小时
6. 使50％体积比的混合蛋白G加mTOR裂解缓冲液，每管加入40μl并孵育在4℃下旋转（Stuart ^TM SB2固定速度旋转器）1小时。
7. 用0.5ml补充有蛋白酶抑制剂的以下缓冲液洗涤免疫沉淀物：
  1. 1x低盐mTOR洗涤缓冲液（补充有0.3％w/v CHAPS）
  2. 2x高盐mTOR洗涤缓冲液（补充有0.3％w/v CHAPS）
  3. 2x mTOR洗涤缓冲液
8. 分裂免疫沉淀等同地进入用于体外激酶测定的三个Eppendorf管中。
准备结合GTP的Rheb
人类Rheb（基因ID：6009）克隆到含有N端GST标签的pDEST27中。
1. 转染四个75cm 2的80％铺满的HEK293E细胞的烧瓶与GST-Rheb-pDEST27（每瓶10μgDNA），使用标准钙磷酸盐转染程序（Schalm等人，2002）。
2. 在10％（v/v）FBS存在下培养HEK293E细胞过夜，直至完全融合（6-7×10 6个细胞）。
3. 在补充有0.3％（w/v）CHAPS（加蛋白酶抑制剂）的1ml Rheb裂解缓冲液中裂解HEK293E细胞。
  注意：应省略还原剂（例如DTT），因为这将干扰与GST-纯化。孵育裂解物在冰上30分钟以利裂解。
4. 孵育预澄清的裂解物（在4℃下在16,200×g离心10分钟后）和固定的40μl50％体积比的混合物 Rheb裂解缓冲液和谷胱甘肽 - 琼脂糖珠，在4℃孵育2小时 °C旋转。
5. 用0.5ml Rheb裂解缓冲液洗涤谷胱甘肽 - 琼脂糖珠两次然后用0.5ml Rheb存储缓冲液补充一次蛋白酶抑制剂。
6. 从50μlRheb中的谷胱甘肽 - 琼脂糖珠上洗脱GST-Rheb 存储缓冲液补充有10mM谷胱甘肽（pH再调节回到8.0）。
7. 孵育洗脱GST-Rheb蛋白在30℃下10分钟与10毫米 EDTA和1mM GDP以产生无活性的Rheb-GDP或10mM EDTA和0.1 mM不可水解的GTPγS以产生活性Rheb-GTP。紧密绑定鸟嘌呤核苷酸至Rheb，添加MgCl 2至终浓度为20mM。在冰上孵育直到使用。
产生用于阳性对照底物的去磷酸化4E-BP1蛋白质
1. 用GST标记的4E-BP1/pGEX质粒转化BL21（DE3）pLys细菌（4E-BP1 GeneID，1978）。
2. 生长细菌直到OD 600是0.6-0.8，以诱导表达加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度并在30℃下孵育3小时。通过离心沉淀细胞在1,500×g下在4℃温育30分钟。
3. 在补充有10mM EDTA，0.1％（v/v）Triton和蛋白酶抑制剂的10ml PBS中冻融细菌。
4. 使用脉冲超声剪切细菌DNA [3 x 5秒周期全功率（30微米）]。在4℃下以16,200×g离心10分钟，然后使用谷胱甘肽 - 琼脂糖珠从细菌上清液中纯化GST-4E-BP1。
5. 脱磷酸GST-4E-BP1蛋白使用50 U虾碱磷酸酶，在PBS，10mM EDTA，0.1％（v/v）Triton X-100中洗涤。洗脱在PBS（pH 7.6）中的10mM还原型谷胱甘肽中。
6. 根据制造商协议使用HiTrap脱盐柱对洗脱液进行脱盐。
7. 使用SDS-PAGE分离并用考马斯亮蓝染色检查针对已知牛血清白蛋白（BSA）的纯度和浓度，标准。
8. 去磷酸化的4E-BP1可以在-80℃下以10μg/μl的等分试样保存以备将来使用。
准备FKBP12 /雷帕霉素药物/蛋白复合物抑制mTORC1
1. 人FKBP12蛋白可以使用其表达和纯化方案以产生上述GST-4E-BP1（省略去磷酸化步骤C5）。
2. FKBP12也可以在-80℃下以10μg/μl等分试样冷冻以备将来使用。
3. 为了产生FKBP12 /雷帕霉素复合物：以10μl终体积（dH 2 O）。在室温下在黑暗中孵育5分钟，并存储在冰上直到需要。
执行mTOR激酶测定
1. 在3x mTOR激酶测定缓冲液中制备mTOR/Raptor免疫沉淀物并根据需要加入75ng Rheb-GTP和/或2μlFKBP12 /雷帕霉素。
2. 在开始激酶测定之前在冰上孵育20分钟。
3. 加入10μlmTOR测定开始缓冲液，补充有500μMATP （在使用前新鲜加入）加150ng纯化的GST-4E-BP1或测试底物以开始测定。磷酸-4E-BP1（Thr 36/45）水平用作阳性对照并指示mTOR激酶活性。
4. 在30℃下在热混合器加热块中孵育30-60分钟，在20FCS下振荡。
5. 通过加入4x样品缓冲液停止反应。
6. 使用SDS-PAGE和western印迹分析样品。代表性数据的示例如图2所示。

代表数据

图2.mTORC1 4E-BP1的定向磷酸化。在存在和不存在GTP的情况下进行的体外mTORC1激酶测定后，显示纯化的GST-4E-BP1的磷酸化的Western印迹 -Rheb。 myc-mTOR和HA-Raptor的水平显示为对照。

笔记

重要的是，Rheb从哺乳动物细胞而不是从细菌中纯化，因为其活性增强mTORC1需要正确的折叠和翻译后修饰（例如异戊烯化）。

食谱

注意：除非另有说明，否则所有缓冲液都储存在4°C。

mTOR裂解缓冲液
40mM HEPES（pH7.4） 2mM EDTA 10mMβ-甘油磷酸盐
低盐mTOR洗涤缓冲液
40mM HEPES（pH7.4） 150mM NaCl 2mM EDTA 10mMβ-甘油磷酸盐
高盐mTOR洗涤缓冲液
40mM HEPES（pH7.4） 400 mM NaCl
2mM EDTA 10mMβ-甘油磷酸盐
mTOR洗涤缓冲液
25mM HEPES（pH7.4） 20 mM KCl
3x mTOR激酶测定缓冲液（等分并储存在-20℃） X3储备溶液：75mM HEPES（pH 7.4），60mM KCl，30mM MgCl 2
将MgCl 2的0.5M储备液的1:50稀释液加入到25mM HEPES（pH 7.4），20mM KCl中。
Rheb裂解缓冲液
40mM HEPES（pH7.4） 10mM甘油磷酸盐5mM MgCl 2/
Rheb存储缓冲区
20mM HEPES（pH8.0） 200 mM NaCl
5mM MgCl 2/
磷酸盐缓冲盐水
137 mM NaCl 10 mM磷酸盐 2.7mM KCl（pH7.4）
mTOR测定开始缓冲液（等分并保存在-20℃） 25mM HEPES（pH7.4） 10mM MgCl 2/
140 mM KCl，以及500μM三磷酸腺苷（ATP），在使用前新鲜加入
蛋白酶抑制剂（1,000x储备溶液等分并储存在-20℃）
10μM亮肽素
2μM抗体
1mM苄脒
1μg/ml胃酶抑素
100μMPMSF
1mM原钒酸钠 1mM二硫苏糖醇（DTT不用于GST纯化）

致谢

该方案按照以前报道的方法进行改变（Dunlop等人，2009）。这项工作是由国际癌症研究协会（AICR）职业发展奖向AT和结节性硬化症协会青年奖学金KD支持。

参考文献

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