材料和试剂

材料
1. 96孔微量滴定板（V底）（Corning，目录号：3897）
2.多通道移液器（Gilson，型号：D10，D200和D1000）的提示
3.离心管（SARSTEDT AG& Co，目录号：72.690）
试剂
1. 病毒抗原
  1. 一个。 H1N1
    A/California/07/2009
  2. H3N2
    A/Brisbane/10/2007
    注意：在含胚卵中扩增病毒。请参阅手册实验室诊断和流感病毒学监测，WHO。
2. 红细胞
  土耳其红细胞（RBC）
  注意：内部RBC和商业RBC都可以使用。
3. 抗体
  人单克隆抗体CT146，CT147，CT149，CT164和CD166
  注意：
  1. 抗体的最大浓度为20μg/ml
  2. 在CHO细胞中表达
  3. 根据制造商的说明纯化[HiTrap TM MabSelect SuRe（GE Healthcare，目录号：11-0034-93）]
4. 其他试剂
  1. 受体破坏酶（RDE）（DENKA SEIKEN CO。，目录号：370013）
  2. 磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）（pH 7.2）（Sigma-Aldrich，目录号P4417）
  3. 生理盐水（0.85％NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）

设备

血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1492）
多通道移液器（Gilson，型号：PIPETMAN Neo ^？多通道）
离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R）
水浴（JULABO GmbH，型号：MB13）
反向常规显微镜（Nikon Instruments Inc.，型号：TS-100）

程序

红细胞的制备
1. 准备稀释的RBC进行洗涤步骤：5ml RBC + 45ml 1×PBS（室温）
2. 洗涤步骤（仅一次）：将稀释的RBC，2,000×g/g，10分钟，25℃离心。
3. 弃去上清液，然后用20ml（初始体积）1x PBS悬浮RBS沉淀
4. 1:100稀释液（0.5ml来自步骤A3的RBC悬浮液+49.5ml1×PBS）
5. 转移到10微升的RBC的步骤d血细胞计数器和计数 RBC在4个方格中的每一个中计算RBC的最终体积
6. 通过以下公式计算RBC的最终体积（公式为参考手册实验室诊断和病毒学流感监测，世卫组织）。
  1. 公式为
    最终体积=计数的细胞总数×初始体积/160
  2. 计算示例
    初始音量= 20
    RBC总数= 320
    最终体积= 320 x 20/160（使用禽红血球时为160;鸡或火鸡为常数）= 40
    然后，向20ml RBC中加入20ml 1×PBS，制成40ml，用于HI测定。
病毒抗原的凝血（HAU）滴定（系列稀释在图1中描述）
1. 加入50μlPBS到第2列到第12列的V底96个孔。
2. 将100微升的每种抗原添加到行的第一口井。
3. 通过转移50μl从第一次进行连续2倍稀释每行的连续孔使用多通道移液器
4. 弃去最终50μl。
5. 向每个孔中加入50μl制备的RBC
6. 将板在室温下孵育30分钟至1小时
7. 记录HAU结果参考图2下面的HAU滴度的实施例
  
  图1. HAU滴定的测试样品的系列稀释液。添加50μl 的PBS加入v-底96孔板的第2-12列的所有孔中然后向每行的第一个孔中加入100μl测试样品。使用多通道移液器将50μl样品转移到下一个孔以进行2倍稀释。稀释因子为1至2,048
  
  图2.HAU滴度的实施例。表面的血凝素流感病毒结合红细胞的唾液酸受体然后创建晶格结构。凝集的晶格保持红细胞悬浮并显示为微红色溶液。凝集效价（HAU）是最后一个孔的稀释因子显示带红色的解决方案。样品1至样品8的HAU滴度为 16，8，32，32，32，16，32及64条。
HI测试的标准抗原制备
1. 通过稀释抗原制备抗原的4个凝血单位（HAU）稀释实施例：如果抗原HAU为16,4倍HAU，用1x PBS稀释4倍。
凝集抑制（HI）试验（系列稀释在图3中描述）
1. 将25μlPBS加入第2至12列的V底96孔中。
2. 加入50μl抗体（用PBS稀释，1:10）到A1行到H1行的孔
3. 将25μl抗体从柱1转移至12，进行2倍连续稀释
4. 向板的所有孔中加入25μl标准抗原
5. 使用实验室振动器混合板10秒或通过手动完全搅拌板
6. 盖上板，在室温下孵育30分钟。
7. 向所有孔中加入50μl制备的RBC，并在室温下孵育30分钟
8. 观察血凝抑制。如果样品抑制血细胞凝集，RBCs通过下沉到孔底部显示为点。记录结果参考下面HI滴度的实施例（图4）
  
  图3.用于HI测定的测试样品的系列稀释。向V-底96孔的第2-12列的所有孔中加入25μlPBS 然后加入50μl测试样品（预稀释1:10）至第一个井的每行。使用多转移25μl样品到下一口井通道移液器使2倍稀释。稀释因子为10至 20,480。
  
  图4. HI滴度的实施例。如果抗体结合到病毒颗粒，流感病毒被有效阻止引起血细胞凝集。 HI滴度值是最后一个稀释因子的抗体显示完全抑制的血凝。 HI滴度样品1至样品8为160,80,80,320,80,160,80和80。

笔记

非特异性抑制剂的失活（在使用血清的情况下）
1. 用生理盐水（0.85％NaCl）体积重建RDE
2. 将3倍体积的RDE加入1倍体积的抗体中
3. 在37℃水浴中孵育过夜
4. 在56℃水浴中加热30分钟以灭活任何剩余的RDE
5. 在室温下冷却并加入6体积的生理盐水。抗体的最终稀释度为1:10。

致谢

我们感谢Jun Myung Kim博士和Sang Hoon Han博士提供Severance医院的血液样本，SC World公司的Yasuo Watanabe博士为抗体筛选的ISAAC分析提供帮助。本研究得到韩国卫生和福利部韩国医疗保健技术研究与发展项目的资助。（国家自然科学基金资助项目（编号A103001），国家自然科学基金（NSFC，批准号81401671），中国科学院战略重点研究计划（编号XDB08020100），中国国家大科技（批准号2015ZX09304005）和。 G.F.G.是NSFC创新研究组的首席主要研究者（批准号81321063）。本报告的结果和结论是作者的结果和结论，不一定代表疾病控制和预防中心或有毒物质和疾病登记处机构的观点。

参考文献

实验室诊断和流感病毒学监测手册世卫组织全球流感监测网络。。。