材料和试剂

12孔细胞培养板（Greiner Bio One International GmbH，目录号：665180）
96孔组织培养试验板（TPP Techno Plastic Products AG，目录号：92696）
1.5ml管（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：7080.1）
细孔直径为8μm的ThinCerts TM 细胞培养插入物（Greiner Bio-One GmbH，目录号：665638）
用于血球计的盖玻片（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：L189.1）
过滤嘴（10μl，20μl，100μl，200μl和1000μl）（Carl Roth GmbH + Co.，目录号：771288,774288,772288,739288和740288）
肿瘤细胞（肺癌细胞系H1975和2106T）
细胞培养基（细胞系特异性），有和没有胎牛血清（FBS）
热灭活的FBS（E.U.-批准，南美来源）（Thermo Fischer Scientific，目录号：10500-064）
1×Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS，无钙，无镁）（Thermo Fischer Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14190-094）}
（Thermo Fischer Scientific，Gibco ^TM，目录号：A11105-01），其中所述试剂盒包括：
丝裂霉素C（AppliChem GmbH，目录号：A2190,0002）
台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
10x细胞裂解缓冲液（Cell Signaling Technology，目录号：9803S）
细胞毒性检测试剂盒（LDH）（Roche Diagnostics，目录号：11644793001）

设备

CO 2细胞培养箱（Panasonic Corporation，Sanyo，型号：SANYO-InCu saFe ）
Neubauer细胞计数室（VWR International，目录号：BRND717810）
微量离心机（Eppendorf AG，型号：5417R）
涡旋混合器（VWR International，目录号：444-1372）
多功能微孔板吸光度读数器（Tecan Trading AG，型号：日出^TM）
Gilson's Pipetman经典移液器（P10，P20，P100，P200，P1000）

程序

图1. 体外肿瘤细胞迁移测定的流程图

在12孔细胞培养板中用期望的测定（例如，靶基因的siRNA敲除或药物递送）处理细胞。
在37℃下，在CO 2培养箱中，将生长培养基更换1ml完全无血清培养基16小时过夜。
在37℃在CO 2培养箱中，用1ml无血清培养基中的10μg/ml丝裂霉素C处理细胞2小时，以抑制细胞增殖。
用1ml无菌1x PBS洗涤细胞一次
加入250微升accutase溶液，孵育细胞约5-10分钟（取决于所使用的细胞的粘附），以分离它们。
向细胞中加入1ml无血清培养基，将细胞转移到1.5ml管中
使用10微升细胞悬液，10微升台盼蓝和Neubauer室计数细胞
将5×10 4个细胞转移到新的1.5ml管中
在室温下用300×g离心细胞悬浮液5分钟。
通过吸取除去和丢弃上清液，加入300μl无血清培养基，上下吸取以解决细胞沉淀。
取一个新的12孔板，并在每个孔中加入500μl含有完全生长培养基的FBS
向每个井中添加ThinCerts ^TM
将第10步中的完整细胞悬液转移到ThinCert ^TM 上。
让细胞在CO 2培养箱中在37℃下迁移24-48小时。
准备一个新的12孔板与1毫升1×无菌PBS在每个孔
准备一个新的12孔板与500微升accutase溶液在每个孔
使用移液器移除ThinCerts ^TM中的无血清培养基。
先用ThinCerts ^TM清洗细胞，用PBS清洗剩余的培养基并转移ThinCerts ^TM直接到含有accutase的板
孵育细胞在孵化器中分离他们。将细胞特异性分离时间从步骤5延长另外5分钟。
轻轻敲打ThinCerts ^TM，以确保细胞完全分离; 舍弃ThinCerts ^TM。
加入1ml含有完全生长培养基的FBS到孔中，并将细胞转移到1.5ml管
在室温下用300×g离心细胞悬浮液5分钟。
用移液管轻轻取出上清液，用1ml PBS重悬细胞
在室温下用300×g离心细胞悬浮液5分钟。
轻轻除去上清液，加入100μl的1x细胞裂解缓冲液，涡旋5秒，并在室温下孵育10分钟。
在室温下用13,000×g的细胞沉淀细胞3分钟
同时，制备LDH反应混合物（根据细胞毒性检测试剂盒制造商的方案）
使用两个技术重复转移40微升的细胞上清液到96孔板。
加入100μl反应混合物，并在室温下孵育10-30分钟。保护板免受光照。
测量490nm处的相对LDH活性。参考波长应大于600nm。

笔记

细胞系的迁移可以极大地变化。没有处理细胞的初始测试可能是有帮助的，特别是当使用不同的细胞系时。
如果需要，与反应混合物的孵育时间可以增加至1小时
光密度（OD 490）应该达到至少0.1以确保有效的酶活性。较低的值表示迁移不良，因为一些细胞系不通过ThinCerts ^TM迁移/em>，黑色素瘤细胞系MeWo）

致谢

我们要感谢联邦教育和研究部，德国和德国肺研究中心，他们在财政上支持这项研究。

参考文献

Schneider，M.A.，Granzow，M.，Warth，A.，Schnabel，P.A.，Thomas，M.，Herth，F.J.，Dienemann，H.，Muley，T.and Meister，M.（2015）。 Glycodelin：一种在非小细胞肺癌中具有免疫调节功能的新生物标记物。 Clin Cancer Res 21（15）：3529-3540。