材料和试剂

50ml Falcon管（VWR International，CellStar ，目录号：188271）
100μm细胞过滤器（BD，目录号：352360）
注意：目前，"Corning，Falcon ^® ，目录号：352360"
1ml注射器（Henke-Sass，Wolf GmbH，Soft-JECT ，目录号：5010-200V0）
5ml注射器（BD，目录号：309646）
Needle-26G（B.Braun Medical Inc.，目录号：4657683）
6孔板（BD Falcon，目录号：353046）注意：目前，"Corning，Falcon ^® ，目录号：353046"。
1.5ml Eppendorf管（Eppendorf AG，目录号：0030123328）
台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，目录号：93595）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10010023）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14040133）
胎牛血清（FBS）（PAN Biotech UK Ltd.，目录号：P30-1506）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
来自溶组织梭菌（Clostridium histolyticum）I型（Sigma-Aldrich，目录号：C0130）的胶原酶
来自溶组织梭菌（Clostridium histolyticum）III型（Sigma-Aldrich，目录号：C7657）的胶原酶
来自牛睾丸的透明质酸酶，I型（Sigma-Aldrich，目录号：H3506）
Dnase I（Sigma-Aldrich，目录号：11284932001）
4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（1μM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15630106）}
乙醇溶液（Sigma-Aldrich，目录号：48075）
抗小鼠CD45 APC抗体（Thermo Fisher Scientific，eBioscience，目录号：17-0451-82）
LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒（Invitrogen，目录号：L23105）
注意：目前，它是"Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：L23105"。
Fc嵌段（抗CD16/32）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience，目录号：16-0161-82）
FACS缓冲区（参见配方）
EDTA缓冲液（见配方）
酶鸡尾酒（见食谱）

设备

解剖剪刀（Fine Science Tools，目录号：91460-11）
弯曲钳（Fine Science Tools，目录号：11073-10）
CO 2供应机器（下一个前进，型号：Quietek CO 2感应系统）
Neubauer细胞计数室（Marienfeld-Superior）
显微镜（Carl Zeiss显微镜，型号：Axiovert 40C）
装备有冷光（Carl Zeiss显微镜，型号：Stemi2000）的解剖显微镜
水浴（Thomas Scientific，型号：1196x11）
BD LSRFortessa（BD Bioscience）

程序

小鼠主动脉的隔离
1. 由适当的动物护理和使用委员会批准的CO 2安乐死小鼠
2. 将鼠标放置在仰卧位置，用针固定手臂和腿到泡沫板上。
3. 喷洒75％乙醇到腹部皮肤，并通过心脏穿刺抽取血液使用固定到1毫升注射器的26G针。
4. 沿中线切开皮肤，皮下组织，从腹部到胸部开腹腹腔; 将皮肤/皮下组织固定到带针的泡沫板上
5. 打开纵隔，切断肋骨。
6. 使用26G针穿刺右心房。
7. 使用连接有26G针的5ml注射器，分别用5ml 2mM EDTA缓冲液，10ml PBS和10ml FACS缓冲液灌注来自左心室的主动脉中的剩余血液。为了避免血液污染，在解剖步骤期间需要使用5ml FACS缓冲液的额外3次灌注。接下来，主动脉应该是白色的。
8. 清除肠，脾，肝，肺，原位离开心脏，肾脏和主动脉。。
9. 在配备有冷光源（放大倍数，2.5x）的解剖显微镜下，仔细解剖和去除位于外膜附近的脂肪组织，同时保持主动脉外膜完整。在这一步，没有形态学上可定义的组织标识符来区分外膜和相邻的脂肪组织（图1）。然而，脂肪组织是软的并且可以容易地去除;主动脉外膜狭窄。
  
  图1.原位解剖。从78周龄的Apoe -/- 小鼠解剖主动脉。指示动脉分支。蓝色虚线表示隔膜的位置。主动脉段中的斑块是白色，用星号表示。相邻的脂肪组织用蓝色箭头表示
10. 小心地去除靠近主动脉的任何淋巴结（图2）。淋巴结为浅棕色。在相邻脂肪组织中还存在一些小的淋巴结，用肉眼不可见，需要解剖显微镜用于检测和去除。
  
  图2.与主动脉相邻的淋巴结。邻近腹主动脉外膜的两个腰淋巴结由黑色箭头指示。在主动脉脂肪组织内或靠近整个主动脉旁结缔组织的也有不可见的小淋巴结。
11. 主动脉分支应保持不变（距离其分支位置0.5厘米长）：无效动脉，左颈动脉，左锁骨下动脉，肾动脉，腹腔动脉和髂总动脉（图1）。
12. 收获整个主动脉，并将其在隔膜水平（图1）切成两个部分：腹主动脉和胸主动脉，如果需要分析个别主动脉段。
13. 为了研究外膜与斑块的细胞，需要从内膜中分离斑块（图1）：纵向打开主动脉，用针固定，并将内膜侧面置于小心地用弯曲的镊子去除斑块。斑块是白色的，容易区分，并且毫不费力地去除
14. 保持主动脉段在冰冷的FACS缓冲液在6孔板，直到酶消化
酶消化（Grabner等人，2009; Hu等人，2015）
1. 酶混合物：400U/ml I型胶原酶，120U/ml XI型胶原酶，60U/ml透明质酸酶和60U/ml DNase1,20mM HEPES的含有钙的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中。
2. 将主动脉从6孔板转移到含有0.5ml酶混合物的1.5ml Eppendorf管中。使用剪刀将主动脉组织切成小块
3. 将主动脉组织的酶混合物转移到50ml Falcon管中。加入另外的2ml酶混合物（2.5ml酶混合物用于每个胸部和腹主动脉总）。
4. 将含有主动脉组织碎片的管子在37℃缓慢振荡下转移到水浴中消化50分钟
从主动脉制备免疫细胞悬浮液
1. 50分钟后，将消化溶液倒入一个100微米的细胞过滤器，放置在一个新的50毫升Falcon管的顶部。
2. 用注射器柱塞和冲洗细胞过滤器用5ml FACS缓冲液捣碎保留的主动脉组织。
3. 从步骤C1-2收集流出物并在300×g离心，4℃10分钟。
4. 离心后小心地除去上清液，并将细胞沉淀重悬于2ml FACS缓冲液中
5. 在光学显微镜下与台盼蓝混合后计数主动脉细胞
主动脉细胞染色和流式细胞术
1. 在300×g离心细胞悬浮液，4℃5分钟
2. 为了阻断Fc受体，将细胞沉淀在100μl1:100稀释的抗CD16/32mAb的FACS缓冲液（1μg/ml终浓度）中在4℃下孵育20分钟。
3. 用300μlFACS缓冲液填充染色管，离心作为步骤D1
4. 弃去上清液和细胞沉淀与100微升1：200稀释的抗小鼠CD45单克隆抗体在FACS缓冲液（1微克/毫升终浓度）在4℃孵育20分钟。
5. 用300μlFACS缓冲液填充染色管，并如步骤D1中离心
6. 用200μlFACS缓冲液重悬细胞沉淀，将样品保存在冰上直到FACS
7. 为了排除死细胞，需要在测量前用细胞染色DAPI，PI或LIVE/DEAD细胞活力测定染料，如Indo-1。

笔记

为了避免来自邻近主动脉的血液或组织的细胞污染，应当在显微镜下非常小心地进行灌注步骤和相关脂肪组织以及淋巴结的去除。 IF染色显示FALC存在于有时接近外膜的主动脉脂肪组织中
血液应该在消化前完全从主动脉冲出。 EDTA缓冲液防止血液凝固，并且其最初用于灌注主动脉。然而，EDTA可抑制需要Ca ⁺⁺的消化酶的活性;在消化开始前，需要冲洗出EDTA。
在主动脉解剖期间，间歇地喷雾FACS缓冲液到主动脉，以防止干燥
钙是胶原酶活性所需的。因此，建议使用含有钙的DPBS来制备酶混合物
消化后的主动脉细胞总数取决于年龄，性别，饮食和小鼠基因型
不同批次的酶活性可能不同。需要每个批次的酶活性测试
酶消化可以去除一些表面抗原。因此，必须在酶消化后测试每个表面标志物。例如，消化后CD138检测将低。
在消化期间，一些细胞将经历凋亡。因此，强烈建议使用DAPI，PI或其他染料对活细胞/死细胞进行流式细胞术染色。
消化后，将产生组织碎片。为了获得"清洁的"FACS图，加入抗小鼠CD45mAb（白细胞标志物）和Indo-1（死细胞染色的标志物）并门控（图3）。

图3.活的CD45 +细胞的FACS图谱和门控。从78周龄的Apoe -/- 小鼠制备主动脉单细胞悬浮液，老鼠。使用Indo-1用抗CD45mAb和死细胞染色细胞。