材料和试剂

培养皿组，玻璃（VWR International，目录号：89000-306）
黑色解剖蜡（CR Scientific，目录号：C3541）
用于固定主动脉的微针（0.15mm直径）（Fine Scientific Tools，目录号：26002-15）
50ml Falcon管（VWR International，CellStar ，目录号：188271）
10ml注射器（BD，目录号：309695）
20ml注射器（BD，目录号：301625）
Sterican单次使用针-23G（B.Braun Medical Inc.，目录号：4657640）
聚-L-赖氨酸包被的载玻片（Menzel Glaeser，目录号：J2800AMNZ）
盖玻片（Menzel Glaeser，目录号：BBAD02400500＃A）
OHP永久标记笔（STAEDTLER MARS LIMITED）
显微镜载玻片保持器/邮包，地点（Sigma-Aldrich，目录号：Z708313-25EA）
低温冷冻保存箱（VWR International，目录号：82021-114）
有盖的染色缸（VWR International，目录号：25460-907）
Grade 410滤纸（VWR International，目录号：28321-077）
聚苯乙烯培养皿（150mm×15mm）（Sigma-Aldrich，目录号：P5981）
乙醇（Merck Millipore Corporation，目录号：1009832500）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P4417-100TAB）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：16005）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：SO389）
异丙醇（Merck Millipore Corporation，目录号：1096341011）
丙酮（Merck Millipore Corporation，目录号：1000141000）
异戊烷（VWR International，目录号：103614T）
注意：在VWR国际网站上也称为"2-甲基丁醛"。
干冰（TKD KABEL GmbH）
苏丹IV（Sigma-Aldrich，目录号：198102）
OCT化合物-Tissue-Tek（SAKURA FINETEK USA，目录号：4583）
Cryomold（SAKURA FINETEK USA，目录号：25608-924）
油红O（Sigma-Aldrich，目录号：00625）
苏木精溶液，Mayer's（Sigma-Aldrich，目录号：MHS-16）
Faramount水性封固剂（Dako，目录号：S3025）
蒸馏水
NaOH
苏丹IV染色溶液（见配方）
油红O（ORO）工作溶液（参见配方）
EDTA（见配方）
PBS（请参阅配方）
多聚甲醛（PFA）（参见配方）
蔗糖（参见食谱）
PFA-蔗糖（参见配方）
黑蜡培养皿（见食谱）

设备

CO 2供应机器（下一个前进，型号：Quietek CO 2感应系统）
解剖剪刀（Fine Science Tools，目录号：91460-11）
精细虹膜剪刀（Fine Science Tools，目录号：14094-11）
弹簧剪（Fine Science Tools，目录号：15009-08）
弯曲钳（Fine Science Tools，目录号：11073-10）
精细缝合镊子（Fine Science Tools，目录号：11063-07）
具有来自顶部的光纤光源的解剖立体显微镜（Carl Zeiss显微镜，型号：Stemi 2000）
测量尺（LACO）
相机（尼康，型号：D5300）
-80℃冷冻器（Thermo Fisher Scientific）
低温切片机（Microm GmbH，型号：HM500OM）
精密加热板（HARRY GESTIGKEIT GMBH，型号：PZ28-2T）
配备有Axiovision release 4.8软件（Carl Zeiss显微镜，型号：490022-0002-000）的Axio-Imager A2显微镜，

软件

统计分析软件[IBM SPSS Statistics 20.0（IBM Corporation，Released 2011，NY，USA）]
Image J软件[美国国立卫生研究院（NIH），美国]
Axiovision release 4.8软件（Carl Zeiss）

程序

小鼠主动脉的隔离
1. 在安乐死前测量小鼠的体重。
2. 如通过地方政府的动物护理和使用委员会批准的通过CO 2吸入安乐死小鼠。死亡是由缺乏呼吸和运动所引起的。
3. 将鼠标放置在仰卧位置，并将手臂和腿固定在带针的软木平台上。
4. 用75％乙醇消毒小鼠的腹侧。
5. 通过腹侧中线切口打开腹腔，并在腹壁中穿过切口
6. 沿着中线将腹部皮肤，皮下组织和腹膜从胸部切开到胸部，并用针将皮肤/皮下组织固定在软木板上。
7. 打开纵隔，切断横向纵隔的肋骨。切割隔膜以方便排水。
8. 在心脏右心房做一个小切口，在灌注前使用1毫升注射器连接一个23G针抽取500-800微升血液。通过使用10ml注射器，随后使用附有23G针的20ml注射器的20ml冰冷PBS，通过缓慢注射10ml PBS中的5mM EDTA，使顶部左心室穿刺穿透脉管系统。在解剖期间用10-20ml冰冷PBS间歇地灌注2-3次，以避免主动脉组织脱水。
9. 使用解剖剪刀和弯曲镊子移除器官，包括肺，肝脏，脾脏，胃肠和生殖器官，同时原位保持心脏，主动脉和肾脏。
10. 将主动脉从心脏暴露到髂骨分叉下方的水平。在放置30-40x放大倍数的顶部配有光纤光源的解剖显微镜下，使用精细虹膜剪刀和精细镊子仔细解剖胸腺。注意，在解剖显微镜下，可以区分紧密主动脉外膜与松散浅黄色棕色脂肪组织在胸部和宽松的白色白色脂肪组织在腹部以及从固体浅黄色/棕色主动脉旁淋巴结原位（图1，左）。在取出肝脏，肠系膜，胸腺和肾脏时，应注意防止主动脉损伤
11. 去除主动脉周围的血管周围结缔组织和脂肪组织以及主动脉分支，包括胸主动脉弓中无名氏，颈总动脉和锁骨下动脉主动脉和腹主动脉的腹腔，肠系膜，肾和髂总动脉，使用精细虹膜剪刀和精细镊子小心（图1，右）。为了清楚，小心地分离靠近主动脉的主动脉旁淋巴结
  
  图1.主动脉的制备和主要分支的主动脉的示意图。在隔离前主动脉准备的图像，示出了对应于右侧示意图的主动脉段的准备，胸腔和腹部的血管周围脂肪组织和主动脉旁淋巴结（左）。新近地被隔绝的主动脉的示意图描述了与它的分支（青绿色）和更低的腹部部分与它的分支（黄色）的上胸部。隔膜指示胸部和腹部之间的边界（右）。

B1。整个主动脉的表面染色（Zhao et al。，2014; Hu等人，2015）。

按照主动脉隔离程序A中的步骤1-11
通过注射5毫升的4％PFA的PBS溶液到左心室，使用10毫升注射器连接23G针，并等待10分钟，然后注入/冲洗用原位固定主动脉组织的5％蔗糖的PBS溶液。
在切断所有主动脉后，从心房基部靠近心房的冠状动脉上方的水平收获整个主动脉，直到腹主动脉的髂骨分叉之下2-3mm。在剖析时要小心，不要切开胸主动脉或腹主动脉
将整个主动脉放在预先准备好的光滑表面黑蜡培养皿中含有PBS。
使用精细虹膜剪刀和精细镊子（图2，左），在解剖显微镜下，在20-25x放大率下轻轻地清洁来自胸部和腹部的主动脉周围的所有软/疏松的血管周围脂肪组织。请注意，施加更多的力或不当的切割可能会损伤外膜或伤害主动脉
在血管周围脂肪组织清洁后，用新鲜PBS重新填充黑蜡培养皿。
切口在胸主动脉中主动脉弓的无名，颈动脉和锁骨下动脉，以及在分叉后3-5mm的腹主动脉中的髂动脉。为了清楚起见，在腹主动脉中切断肾动脉（图2，左中）
将一个髂总动脉的开口端用细针固定。使用弹簧剪刀从未固定的髂总动脉纵向切开主动脉，并沿着主动脉弓的内曲率向前行进。使用minutien针将分离主动脉固定到黑色夹层蜡上。（图2，中右）
沿主动脉的外曲率从主动脉根部通过无名，颈动脉和锁骨下动脉切开，直到主动脉弓类似于Y形裂口。将Y形主动脉弓压平在黑色蜡上，并固定主动脉部分（图2，右中）。
在室温下用PFA-蔗糖将钉扎主动脉固定在黑蜡培养皿中过夜
用1x PBS冲洗3次，每次10分钟，并在室温下用70％乙醇固定5分钟。使用振动器是可选的。
用苏丹IV染色溶液在室温下染色10分钟。苏丹IV将染色富含脂质的斑块红色，留下含有非斑块的区域变浅（图2，右）。建议在染色前清除所有可见的血管周围脂肪组织，因为苏丹IV染色的血管周围脂肪组织可能产生假背景并干扰斑块形态测定。
在室温下用70％乙醇冲洗2次，每次3分钟。注意，过度冲洗会使斑块脱色。用1×PBS冲洗5分钟以除去乙醇
用1 x PBS填充黑蜡培养皿，直到它覆盖染色的主动脉和针
在黑蜡培养皿中靠近固定主动脉放置一个测量尺。
使用数码相机从顶部连接到支撑架上拍摄图像。

图2.整个主动脉的动脉粥样硬化病变分析在解剖显微镜下（左，中左）从新鲜分离的主动脉去除血管周围脂肪组织并修剪分支动脉。纵向分裂和固定整个主动脉，然后在面中染色（右中间）。用于苏丹-IV染色的全主动脉的形态测定分析的总主动脉表面积和斑块表面积的计数（右）。

B2。主动脉横截面的染色（Hu等人，2015; Grabner等人，2009）

按照主动脉隔离程序A中的步骤1-10
切断所有胸和腹部分支动脉在他们从主动脉的分叉之后3-5 mm。
隔离整个主动脉与相邻的脂肪组织的主动脉的外部薄层外围的1mm外围从解剖显微镜下的冠状动脉上方的水平在胸部的心脏基底的心房附近到髂骨分叉下面的水平（2-3毫米）的腹主动脉。（图3，左）。
将主动脉切成4部分：从心脏基底到胸主动脉根部的第5肋骨的水平，胸主动脉弓包含无名的主动脉弓，右锁骨下，右锁骨颈动脉，左颈动脉和左锁骨下动脉，以及长下行胸主动脉;胸部II从第7肋骨的水平到包括肋间动脉的隔膜;腹膜下腹膜到腹主动脉的中部，包括腹腔，肠系膜上，左右肾动脉;和腹部-II从腹主动脉中部到髂骨分叉水平以下，包括肠系膜下部和髂骨分叉处的髂总动脉（图3，左）。
将OCT包埋培养基组织切片置于标记的低温模型中，然后如图3（中间）所述将4份转移到模具中。使用永久性记号笔绘制嵌入主动脉部分在冷冻切片后部的方向（图3，中间）。
用组织tek补充cryomold直到所有主动脉部分完全嵌入。在包埋介质中将主动脉节段调整到相同的水平。
如果要测量无名动脉中的动脉粥样硬化，将胸腔镜I嵌入单独的模具（可选）。
快速冷冻含有主动脉段的模具在用干冰冷冻的异戊烷中的组织tek中3-5分钟，直到组织块变成固体和白色。
保持冷冻的组织块在干冰上30分钟，并存储在-80°C冰柜直到冷冻切片
在组织切片前1小时将冷冻的组织块转移到低温恒温切片机的-20°C室。根据步骤B2中步骤5中嵌入主动脉部分的方向，在组织块上标记切割面。
使用低温恒温切片机在-20°C制备10μm厚的新鲜冷冻主动脉横切面，并将其小心收集到标记的聚-L-赖氨酸涂层的载玻片上。为了获得良好质量的平面冷冻切片使用新的刀片，均匀施加力到切片机的轮，并且不在组织收集期间移动幻灯片。新用户应在切开主动脉之前练习至少10次练习组织，如肝脏或脾脏
以100μm的间隔收集每10个连续主动脉切片，用于油红O和苏木精染色，并保留其他切片进行进一步染色。
在室温下将含有组织切片的玻片在空气中干燥1小时，将其保持在防潮涂布的冷冻箱内的载玻片保持器中，并储存在-80℃冰箱中，直到进一步使用。
染色前，将载玻片从-80°C冰箱中取出，并在37°C的热板上解冻1分钟，然后风干1小时。
用4％PFA固定载玻片5分钟，然后在染色罐中用60％异丙醇固定5分钟
在室温下用油红O工作溶液将载玻片染色10分钟
用60％异丙醇冲洗载玻片3次，每次2秒，然后在自来水中短暂洗涤
在室温下用苏木精染色载玻片6分钟
在自来水中彻底清洗后，将载玻片浸入自来水中10分钟
用极端的水性封固剂将盖玻片安装在载玻片上。在安装之前不要风干幻灯片，每个幻灯片使用2-3滴安装介质，通过从幻灯片的一侧缓慢安装盖玻片避免气泡。
安装在RT中后，将载玻片放置30-60分钟，直到盖玻片牢固地连接到载玻片。不要移动或摇动幻灯片以避免气泡或组织损坏。

图3.主动脉横截面的动脉粥样硬化病变分析。与胸部和腹部血管周围脂肪组织隔离的主动脉（左）。注意，主动脉弓中的血管周围脂肪组织被去除以便更好地观察分支动脉。不同主动脉节段的分离和包埋的示意图，包括具有其上方的分支（青色）和胸部-II（绿色）的胸部I，具有其分支的腹部-I（黄色）和腹部-II及其分支隔膜（中间）。旋转胸部-I 180°角嵌入。箭头表示切割方向。对油红O和苏木精染色的无名动脉（右）进行形态计量分析的管腔面积，内弹性层（IEL）和外弹性层（EEL）面积的计数。

C1。染色主动脉的形态测量（Hu等人，2015; Daugherty和Rateri，2015; Schmitt等人，2014）

将染色的总主动脉的图像转移到配有Image J软件的计算机上。
将数字图像的测量刻度距离调整为Image J程序的像素刻度。
手动环绕主动脉的外边界线，并测量总主动脉的面积。
围绕主动脉表面内的每个苏丹 - 四染色的斑块表面（强烈的红点）并测量其面积。小心排除任何苏丹IV染色的脂肪组织，通常位于主动脉外膜下方，与斑块相比较少红色（图2，右）。
将所有测量结果导出为excel文件以计算斑块面积与总主动脉面积的比率，并将该值归一化为斑块面积的百分比。
任选地，可以在主动脉弓（从主动脉根到锁骨下动脉分支以下3mm），下行胸部（从主动脉弓水平到腹腔动脉分支上方的隔膜水平）测量斑块面积，腹主动脉（在隔膜以下，直到髂骨分叉）在总主动脉中的斑块面积的形态测量。
对于统计学，使用8-10只小鼠

C2。油红O染色和苏木精染色的主动脉横断面的形态测定（Hu等人，2015; Grabner等人，2009）

调整显微镜的亮度和对比度。使用Axio-Imager显微镜，使用10x物镜成像无名动脉和5x物镜成像腹主动脉切片，获取主动脉切片的明场图像。
使用Axiovision release 4.8软件在手动包围它们后测量区域（图3，右）：

测量内膜/内腔边界包围的区域。
测量由动脉介质的内弹性层（IEL）包围的区域。
测量由动脉介质的外部弹性膜（EEL）包围的区域

注意，可以容易地鉴定培养基中的富含对比度的弹性蛋白纤维，内膜/培养基或培养基/外膜边界，并且可以使用Axiovision显微镜容易地将外膜与相邻的脂肪组织区分开。
将测量数据导出到Excel文件以计算内膜和介质面积
通过从IEL面积中减去EEL面积，从管腔面积和介质面积中减去IEL面积，计算内膜面积。
计算内膜面积与介质面积的比率：方程：内膜/介质比率=内膜面积（IEL-内腔面积）/介质面积（EEL-IEL面积）。内膜/中膜比表示斑块尺寸的归一化值
计算在8-10 ApoE ^-/-小鼠中的至少10个连续主动脉横截面（每第10个切片）中的内膜/中膜比。
对于多个小鼠组之间的形态测量数据比较的统计分析，建议使用广义估计方程模型（GEE）模型来用软件IBM SPSS Statistics 20.0（Hu等人，/em>，2015）。
将数据表示为平均值和标准误差（SEM）。使用Bonferroni事后检验的多重检验计算显着性的P值。

笔记

在主动脉解剖期间，定期将PBS注入左心室，以保持主动脉湿润和防止脱水。
除去所有血管周围脂肪组织，获得清晰的苏丹-IV染色与较少的背景。
因为动脉粥样硬化的水平在个体ApoE -/-/- 小鼠之间不同，所以使用每个实验组相同性别和年龄的8-10只小鼠是可取的。
在每个小鼠具有重复测量的多个比较数据集的情况下，即来自相同小鼠的几个数据点，GEE模型考虑每个个体的这些测量值的相关性，并且提供对标准误差的鲁棒估计的回归系数。这意味着，即使在所选择的相关结构的错误指定，关于组差异的推论仍然是无偏的，这与包括方差分析（ANOVA）的传统线性回归模型相比是一个明显的优点。不使用方差分析的主要原因是它假设每个数据点是一个单独的实体，并忽略随机效应，即小鼠之间的生物学差异。相比之下，GEE将每只小鼠视为一个单独的实体;斑块面积或大小作为因变量;和基因型，主动脉区（无名动脉或腹主动脉）作为反应。

食谱

苏丹IV染色溶液
在35ml乙醇，50ml丙酮和20ml蒸馏水的混合物中溶解500mg苏丹IV 不时搅拌直到苏丹IV溶解
油红O（ORO）工作溶液
将0.5g ORO与100ml异丙醇溶解以制备ORO储液
将6份原液与4份蒸馏水混合
让溶液静置24小时
使用之前使用410级滤纸
过滤溶液在室温下贮存
5mM EDTA
将14.612g EDTA与80ml蒸馏水混合以制备50mM EDTA
使用磁力搅拌器剧烈搅拌溶液
使用NaOH将pH调节至8.0 用蒸馏水
调节体积至100 ml 将10ml 50mM EDTA储备溶液与90ml蒸馏水混合在室温下贮存
1x PBS
将1个PBS片溶于200ml蒸馏水中
在室温下贮存
4％多聚甲醛（PFA）
将40gm的PFA与800ml的1x PBS混合
在通风橱下在62℃下搅拌溶液
使用NaOH将pH调节至7.4 加入蒸馏水使溶液达到1000ml
储存在4°C
5％蔗糖将5g蔗糖溶于100ml1×PBS中
使用NaOH将pH调节至7.4 在室温下贮存
PFA-蔗糖将5g蔗糖溶解在100ml的4％PFA中使用NaOH将pH调节至7.4 在室温下贮存
黑蜡培养皿
熔体黑色解剖蜡在烘箱中在80℃下2-3小时
将其在室温下冷却过夜，
在室温下储存

致谢

这项工作由德国研究理事会（HA 1083/15-4; AJRH; MO 3052/1-1至SM; YI 133/2-1至CY）和欧洲研究理事会（AdG 249929至CW）。

参考文献

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