材料和试剂

玻璃毛细管[用于微量注射器的（Sutter Instrument Company，目录号：BF100-50-10）或用于口腔移液管的（World Precision Instruments，目录号：1B150F-3）
无菌纱布（KAWAMOTO CORPORATION，目录号：7164）
手术带（3M，目录号：1527SP-0）
外科手术刀刀片（Swann Morton，型号：No.11）
缝合针（Alfresa pharma，目录号：HT1605NA75-KF2）
E11.5（或E10〜12）怀孕小鼠
QIAFilter质粒大量试剂盒（QIAGEN，目录号：12263）
Fast green（Sigma-Aldrich，目录号：F7258）
戊巴比妥钠（三新戊基）（KYORITSU SEIYAKU CORPORATION，目录号：4992945014418）
乙醇
盐酸利托君（Sigma-Aldrich，目录号：R0758）
（可选）EEG导电糊（NIHON KOHDEN CORPORATION，目录号：Z181JE）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H4034）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
磷酸氢二钠12水（Na 2 HPO 4·12H 2 O）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-02835） br />
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：169-04245）
HEPES缓冲盐水（HBS）（见Recipes）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见Recipes）

设备

Micropipette puller（Sutter Instrument Company，型号：P-87）
具有40x物镜的显微镜（Nikon Instruments Inc.，型号：Eclipse E100）
剪刀，细钳和环钳
方波电穿孔仪（Nepa Gene Co.，型号：CUY21SC）
镊子型电极（Nepa Gene Co.，型号：CUY650P3）
微量注射器（Eppendorf AG，型号：5242）或口腔移液器
带柔性光导的LED光源（Kenko Tokina，型号：KTX-20L）
反射7mm伤口夹子施放器（Cellpoint Scientific Inc.，目录号：204-1000）

程序

DNA制备
1. 使用QIAGEN质粒maxi试剂盒纯化质粒。将质粒溶解到1×HBS中以制备质粒储备溶液。建议4 mg/ml或更高浓度的质粒储备液。质粒储备溶液可以在4℃保存几个月，但新鲜质粒带来好的结果
2. 将质粒稀释到30〜60μl1×HBS中，终浓度为2-5 mg/ml。加入1/100体积的1％快速绿色溶液
制备用于DNA注射的玻璃微量移液管
1. 用微量吸液管拉出玻璃毛细管。
2. 使用外科手术刀刀片切割直径为30-45μm的拉拔移液管的尖端（图1B）。切割边缘必须锐化，而不是干净的切割形状（图1A-B）。在显微镜下检查切边。制作3〜5个玻璃微量移液器
  
  图1.具有锐利边缘的玻璃微量移液管。A.玻璃微量移液管尖端的代表图像（比例尺，10μm）。 B.切割边的示意图。
电穿孔
1. 通过腹膜内注射戊巴比妥钠（50-60μg/g体重）麻醉怀孕的小鼠。所有与动物护理和治疗相关的程序都按照庆应义io大学动物资源委员会规定的指南进行
2. 将质粒溶液填充到玻璃微量移液管中
3. 将麻醉的鼠标与腹部上面，用手术胶带轻轻地固定在操作板上的尾巴和四肢。用70％乙醇擦拭腹部皮肤。
4. 用剪刀剪下腹部皮肤的中线，然后腹壁。
5. 在切口周围放置无菌纱布。用无菌温PBS浸湿纱布。将100-200μl盐酸利托君盐溶液（0.1 mg/ml）加入腹腔内以放松子宫肌肉。
6. 在切口的一侧用细镊子夹住腹壁，将环镊子插入腹部，并小心地拉出两个子宫角中的一个。滴无菌温暖PBS整个暴露的子宫角。手术期间用PBS保持子宫湿润。
7. 使用嘴移液管或微量注射器（视频1）注入DNA溶液到第四脑室。为了可视化第四脑室，用侧面或下面的LED灯照亮胚胎。抓住胚胎之间的光和你的手指。轻轻推动胚胎，使第四脑室固定在子宫的表面部分（图2A-B）。将玻璃微量吸管通过子宫壁插入第四脑室，并通过空气压力注射DNA，直到第四脑室的嘴部填充DNA（图2C）。对于胚胎，注射DNA溶液需要5秒或更长时间
  
  图2. DNA注射到第四脑室和电穿孔的示意图。 A。通过子宫保持胚胎的示意图; B.光照显示第四脑室;第四脑室充满注射的DNA溶液（蓝色）的示意图;电穿孔示意图。
8. 用温热的PBS湿润子宫和电极。将电极的正端连接到第4脑室的顶端边缘（视频2）。负端位于背部或颈部。如果难以在子宫上紧密接触电极，则在电极上放入少量EEG糊剂以填充电极和子宫之间的间隙。施加电脉冲（33 V，持续时间为30 ms，每个脉冲间隔970 ms，5个周期）。输送45〜50mA电流（图2D）。对于E10-12处的胚胎，应用两到四组电脉冲。太多的电脉冲可能是有害的。
9. 移动到下一个胚胎，并重复步骤C7-8。当完成了两个子宫角之一，用你的手指轻轻地把它们放回腹部。
10. 拉出另一个子宫角，就像步骤C7一样。如果子宫壁不放松，直接滴露50微升盐酸利托君盐（0.1毫克/毫升）暴露的子宫角。执行步骤C7-9。重要的是在40分钟内完成步骤6-10。长期手术可导致胚胎或怀孕老鼠死亡。
11. 电穿孔子宫返回腹部后，缝合腹壁的伤口
12. 用伤口夹闭合皮肤。
13. 在温暖（〜37°C）条件下恢复小鼠。将鼠标返回到主笼。
14. 可以在胚胎或出生后年龄分析电穿孔小鼠（图3）。在E11.5电穿孔的小脑蚓部中，95％的转染细胞是浦肯野细胞。
  
  图3. IUE的代表性结果。 E11.5小鼠用编码EGFP的质粒电穿孔并在P33分析。 A。在小脑的右半部分（比例尺，2mm）中观察到通过EGFP的Purkinje细胞的镶嵌标记。在该实施例中，在电穿孔期间将电极的正端放置在脑室下区的右侧; B. A（比例尺，1mm）中显示的电穿孔小脑的矢状切片。

代表数据

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视频1. DNA注射到第四脑室

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视频2.电穿孔

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食谱

HEPES缓冲盐水（HBS）
21 M HEPES
137 mM NaCl 5 mM KCl
0.7mM Na 2 HPO 4
磷酸盐缓冲盐水（PBS）[无菌并预热（37℃）]
137 mM NaCl 2.7 mM KCl
8.1mM Na 2 HPO 4
1.47mM KH 2 PO 4 sub/

致谢

该协议改编自Nishiyama em al。（2012）。这项工作是由日本促进科学协会支持。

参考文献

Nishiyama，J.，Hayashi，Y.，Nomura，T.，Miura，E.，Kakegawa，W.and Yuzaki，M。（2012）。通过子宫内电穿孔在小鼠浦肯野细胞中选择性和受调节的基因表达。 Eur J Neurosci 36（7）：2867-2876。
Takeo，Y.H.，Kakegawa，W.，Miura，E。和Yuzaki，M.（2015）。 RORalpha调节小脑浦肯野细胞中树突发育的多个方面体内。 J Neurosci 35（36）：12518-12534。