材料和试剂

具有1.5盖玻片厚度的12孔MatTek板（MATTEK，目录号：P12G-1.5-14-F）
18G非柔性不锈钢口腔管饲针（Cadence，Inc.，目录号：7906）
10ml的注射器（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific ，目录号：14-823-2A）
50ml无菌Falcon管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：339653）
无菌12孔细胞培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：CLS3513）
15ml无菌Falcon管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：339651）
预冷无菌移液器吸头
注意：
1. 任何无菌的提示，可以与实验室的移液器一起使用。
2. 这些尖端可以在电镀之前1小时置于-20℃的冷冻器中30分钟或在4℃的冰箱中。
70μM细胞过滤器（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific ，目录号：08-771-2）
C57BL/6小鼠（雄性或雌性，6-8周龄）
异氟烷（Allivet，目录号：50562）
无钙或镁的冰冷无菌1x DPBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：14190-235）
UltraPure EDTA（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15576-028）}
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：SO389）
D-山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
Matrigel 基底膜基质（Corning，目录号：356237）
注意：使用前的夜晚在4°C解冻。
表皮生长因子（EGF）（R& D Systems，目录号：2028-EG-200）
Noggin（R& D Systems，目录号：1967-NG-025/CF）
R-spondin（R& D Systems，目录号：3474-RS-050）
Wnt3A（R& D Systems，目录号：1324-WN-010）
Advanced DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：12634-010）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25030-081）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15140-148）
1 M HEPES（pH 7.0-7.6，无菌过滤）（Sigma-Aldrich，目录号：H0887）
N2补充剂（R& D Systems，目录号：AR003）
B27补充物（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：17504-044）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10437-028）
Click-iT EdU细胞增殖测定（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：C10337）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A8531）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
TO-PRO-3碘化物（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：T3605）
螯合缓冲液，准备新鲜（见配方）
摇晃缓冲区（请参阅配方）
Minigut培养基（参见配方）
2％甲醛（见配方）

设备

剪刀（Fisher Scientific，目录号：08-951-20）
Sorvall Legend X1R离心机（或其他大型冷冻离心机）
37℃，5％CO 2细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：HERAcell 150i）中。
LSM 510 META具有647（TO-PRO-3）和488（EdU）发射滤光片的倒置（或其他倒置激光扫描）共聚焦显微镜

软件

ImageJ图像分析软件

程序

收获和培养小肠肠道
1. 麻醉和牺牲鼠标异氟烷，然后颈椎脱臼
2. 解剖近10厘米的近端肠（十二指肠，附近的胃，图1A）。
3. 用冰冷的PBS填充10 ml注射器，并将口服管饲针注射到注射器
4. 将管饲针插入近端肠（从步骤A2）。用冰冷的PBS冲洗肠（图1B）。
5. 切开肠纵向打开（图1C），切成1厘米的块，并转移到15毫升锥形管（图1D）5ml冰冷PBS。涡旋3秒以去除松散的绒毛
  
  图1.用于隐窝隔离的小肠的处理。A.移除小肠后，应收集最近的10cm用于进一步处理。 B.然后使用连接到10ml注射器的管饲针将该部分用冰冷的PBS冲洗。然后将肠切片二等分。 D.然后将对分的肠切成约1cm切片，并转移到含有5ml冰冷PBS的15ml锥形管中。
6. 吸取PBS上清液并丢弃。
7. 用10ml冰冷的PBS洗涤剩余的肠片，涡旋，并用移液管去除上清液并丢弃。
8. 转移组织到5毫升螯合缓冲液和岩石在4℃下10分钟
9. 用移液器从组织中移除螯合缓冲液，用10毫升冰冷的PBS洗涤组织两次。
10. 加入5 ml冰冷PBS。
11. 摇动2分钟。不要用太多的活力摇动。该震动包括以均匀的速度从肘部全臂运动（每秒一次向下冲击，视频1）
12. 倒掉第一次摇动的上清液并丢弃，因为这种上清液将主要含有绒毛。
13. 加入5 ml PBS，重复摇动2分钟。检查上清液的隐窝。要开始检查隐窝，移取20微升的PBS上清液到12孔细胞培养皿的井和视图在4倍放大在细胞培养范围内。寻找多个隐窝，其中可以看到Paneth细胞的黑色颗粒（图2）。摇动后，上清液应主要含有绒毛，看起来像图2左侧的图像。
  
  图2.绒毛和隐窝在4x和20x放大率下的代表图像。红色箭头表示隐窝。左侧的图像代表在步骤A13之后可能看到的那些图像。右侧的图像显示了在步骤A18之后将看到的最佳隐窝组合物
14. 通常，这里没有看到隐窝，也可以倒出上清液，但是这非常依赖于摇动技术，因此应检查上清液的隐窝。
15. 加入5毫升新鲜的螯合缓冲液，并在摇床上4℃螯合10分钟
16. 滗析螯合缓冲液，小心不要失去1厘米的小肠，然后加入5毫升冰冷的PBS（洗涤）。丢弃PBS并执行第二次洗涤。弃去洗液，加入5 ml冰冷的PBS摇匀
17. 摇动2分钟。检查隐窝。如果你在这里，你可以过滤和保存，但通常最好的隐窝是在第二个2分钟摇动后看到。虽然结果将根据摇晃变异性而不同，但是这种摇动的上清液通常含有90％绒毛和10％或更少的隐窝。
18. 执行第二个2分钟摇动并检查隐窝。在第二次摇晃之后，通常存在相等数量的隐窝和绒毛。最终，大于或等于70％隐窝与30％绒毛的比率是最佳的。如果隐窝仍然没有看到丰富，更剧烈摇动30秒间隔，继续检查隐窝，直到看到至少20隐窝每20微升等分试样。
19. 通过70μM过滤器过滤到50ml管中。用5ml冷摇动缓冲液冲洗过滤器。
20. 隐窝在4倍放大率下清晰可见，并且可以在代表性的20μl隐窝等分试样中计数。应该预期每20μl溶液至少20个隐窝，产生约5,000个隐窝的典型总产量。计数隐窝，并将足够的体积，每两个孔1500个隐窝转移到预冷的15ml锥形管中。
21. 在4℃下以1,000rpm离心10分钟。吸出摇动缓冲液，小心不要打扰沉淀
22. 使用预先冷却的移液器吸头和保持所有的试剂在冰上，重悬在每孔50微升Matrigel的隐窝，包含：
  1. EGF：50ng/ml（0.25μl100μg/ml每50μlMatrigel）
  2. 头蛋白：100ng/ml（1μl50mg/ml每50μlMatrigel）
  3. R-Spondin：500ng/ml（1μl250μg/ml每50μlMatrigel）
  4. 对于初始培养物，也可以用Wnt3a（2μl50μg/ml Wnt3a /50μlMatrigel）刺突。该步骤不是必需的，但是将增加肠类的电镀效率。
  注意：
  a。将生长因子以非常小的等分试样存储在-80°C。
  b。重新悬浮隐窝时，请务必完全重悬，不要加入气泡。移液器进出使用P200集体积小于总体积25微升，从未完全排除或拉入Matrigel/crypt混合物。该步骤可以在室温下在细胞培养罩中进行，将试剂保持在冰桶中直到铺板。
23. 使用预冷的移液器吸头，平板到MatTek板的盖玻片部分，使Matrigel在孔中心形成一个隆起的圆顶（图3A）。
24. 将培养板置于37℃的培养箱中30分钟（或更长，最多2小时），使Matrigel完全聚合。
25. 用350μlMinigut培养基重叠Matrigel（图3B）
  
  图3.将Matrigel电镀到12孔MatTek平板上的图像。将含有隐窝的基质胶移液到孔的中心，避免任何气泡形成。 B.在Matrigel设置后，将媒体添加到每个孔中。
26. 增殖染色
  1. 根据待分析的过程，可以在肠后注入的任何点进行增殖染色。如果最初的生长速率是有问题的，只有一天后，肠道菌群可以在培养中染色。如果要确定对治疗的反应，则最好允许肠内生长在增殖染色前生长至少4天，以确保它们形成完全隐窝（参见图4，用于在涂布后不同时间的肠类似物的比较）。根据所需的输出量，也可以在染色前的指定时间进行处理
    
    图4.电镀后1天，3天和5天的代表性图像
  2. 根据制造商的说明书，使用Click-iT EdU细胞增殖测定法测定增殖
  3. 用新鲜的预热的Minigut培养基和10μMEdU的工作溶液替换类肠毒素培养基
  4. 在正常生长条件下孵育肠道15分钟。
  5. 从瓶中取出介质，更换为1毫升的2％甲醛的PBS溶液，在4℃下孵育过夜
  6. 第二天早晨，轻轻取出固定液，用1ml 3％BSA的PBS溶液洗两次
  7. 轻轻取出最后一次洗涤，加入1ml 0.5％Triton X-100的PBS溶液，在室温下孵育20分钟。
  8. 准备Click-iT反应鸡尾酒（根据制造商的说明），并添加每孔500μl。短暂摇动板以确保均匀分布。在室温下孵育肠衣30分钟，避光保护
  9. 取出反应混合物，用1ml含3％BSA的PBS洗涤各孔一次
  10. 用500μl的TO-PRO-3（PBS中1:500）在室温下去除洗涤溶液并复染细胞核15分钟。 TO-PRO-3使得非增殖和增殖细胞能够通过其细胞核鉴定，从而可以确定增殖百分比。
27. 成像的小肠肠道
  1. 类肠毒素可以在LSM 510 META或类似的反向共聚焦显微镜上成像。在488（EdU）和647（TO-PRO-3）通道中进行成像，并且采取Z堆叠以确保肠道的三维成像（图5A-B）。
  2. 增殖可以量化为每个隐窝区域的EdU + sup +细胞，其中使用ImageJ图像分析软件确定隐窝面积。或者，增殖可以量化为相对于通过TO-PRO-3 ^{+ 核确定的总细胞数的EdU ⁺细胞的百分比。
    
    图5.增殖性肠道的代表性图像。在铺板后的（A）3天和（B）5天时，对于增殖标记EdU（绿色）已经对类毒素进行染色。复染色为TO-PRO-3（核，红色）}