材料和试剂

0.5ml胰岛素注射器（Terumo Corporation，目录号：SS05M2713M）
（Corning，目录号：352070）
40μm尼龙网孔过滤器（Corning，目录号：352340）
6孔板（TPP Techno Plastic Products AG。，目录号：92006）
细胞计数物质
5ml圆底聚苯乙烯试管（Corning，目录号：352235）
C57BL/6小鼠
CpG B-1826（5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3'）（Sigma-Aldrich，PrOligo，custom made）
N- [1-（2,3-二油酰氧基）丙基] -NNN三甲基铵甲基硫酸盐（DOTAP）（Roche Diagnostics，目录号：11202375001）
来自鸡蛋白（OVA蛋白）的白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A5503）
无菌DPBS，1x（Life Technologies，Gibco，目录号：14190-094）
注意：目前，"DPBS，无钙，无镁（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM"，目录号：14190 -094）"。
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）（Life Technologies，目录号：C1157）
注意：目前，它是"（5-（和-6） - 羧基荧光素二乙酸酯，琥珀酰亚胺酯）（CFSE）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ，目录号：C1157）"。
ACK裂解缓冲液（1x）（Lonza Group Ltd.，目录号：10548E）
RPMI 1640 Medium，GlutaMAX （Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：61870-010）
青霉素/链霉素（Life Technologies，Gibco ^TM，目录号：15140-12）
注意：目前，它是"青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：15140122）/em>
肽SIINFEKL（多肽组，定制）
胎牛血清（Thermo Fischer Scientific，Hyclone ，目录号：SV30160.03）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
FACS缓冲区（参见配方）

设备

解剖套件（含剪刀，弯钳）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）
MyBath ^TM 4迷你水浴（Benchmark Scientific，型号：B2000-4）
流式细胞仪：青色（Beckman Coulter）或Fortessa（Becton Dickinson）

程序

第0天。
1. CpG-B 1826（30μg/小鼠）
2. DOTAP（60μg/小鼠）
3. 卵白蛋白（100μg/小鼠）
  将所有试剂在无菌1×DPBS中稀释（至最终总体积为200μl/小鼠），并通过静脉内（i.v.）眼后眼注射在每只小鼠的眼中接种最终溶液。作为免疫的对照，一些小鼠接受无菌的1×DPBS的后眼窝注射：这些幼稚/未免疫的小鼠用于计算与免疫的小鼠相比的特异性裂解的％。
  原始非注射小鼠也将用于分离脾细胞并用肽脉冲它们，并且还将用作对照小鼠（参见步骤B14）。
第7天注射用该肽脉冲并用高浓度的未用该肽脉冲但用低浓度CFSE标记的CFSE +脾细胞标记的脾细胞
1. 分离幼稚的未注射小鼠的脾脏（每3只OVA免疫的或DPBS注射的小鼠+对照小鼠1只未注射的小鼠），并将每个脾脏置于孔（6孔板）中。
2. 机械地破坏脾脏以在小体积的DPBS（1-2ml）中获得单细胞悬浮液，然后用DPBS洗涤细胞并离心（652×g，5分钟，+ 4℃）。
3. 重悬细胞沉淀，用ACK裂解缓冲液处理以裂解红细胞：每脾脏加入2ml ACK，孵育2分钟（室温，室温）。
4. 用2-3ml RPMI +青霉素/链霉素洗涤每个脾悬浮液，并在细胞过滤器（40μm）上过滤。将悬浮液一起集中在一个Falcon 50管中（或更多，如果许多脾用于实验），加入RPMI +青霉素/链霉素，直至达到50ml并离心（625×g，5分钟， + 4°C）。
5. 弃去上清液，并在RPMI +青霉素/链霉素中重悬沉淀;将脾细胞分成两半。将肽加入一半（肽SIINFEKL10μg/ml，终体积为每个半脾2ml）。例如：如果10个脾用于实验，10个半脾用SIINFEKL（意指10×2ml = 20ml最终体积）脉冲，而另一半（等于体积作为脾的最终体积+ SIINFEKL;在我们的示例：20 ml）将保持无肽
6. 在37℃下在水浴中孵育两种悬浮液30分钟。每10分钟轻轻混匀。
7. 在RT DPBS 1x中洗涤并离心（625x g，5分钟，+ 4℃）两次。
8. 同时，在黑暗中制备两种CFSE溶液（1×DPBS中的稀释液）：
  1. CFSE ^{高溶液：2.5μM（从保持在-20℃的储备溶液稀释）}
  2. CFSE ^{低溶液：0.25μM（来自CFSE ^{高溶液的稀释1/10）}}
9. 弃去上清液并将每个沉淀重悬于1ml DPBS中并计数细胞
10. 然后，将必要体积的CFSE溶液加入到它们各自的细胞悬浮液中，以获得10 7个细胞/ml的最终浓度，如下：
  1. （2.5μM的CSFE）刺激的脾细胞的CFSE高度溶液。
  2. CFSE ^{低溶液施用于无肽的脾细胞（0.25μM的CSFE）}
  在室温下在黑暗中孵育15分钟。
11. 用40ml RPMI + 10％FCS洗涤每种悬浮液并离心（625×g，5分钟，4℃）。
12. 弃去上清液并再次用RPMI + 10％FCS洗涤并离心（625×g，5分钟，4℃）。
13. 弃去上清液，将沉淀重悬在1×DPBS中，计数细胞：
  1. 用肽（和CFSE ^高）脉冲的脾细胞
  2. 无肽的脾细胞（和CFSE ^低）
  将每种悬浮液重悬于DPBS中，以获得5×10 6 /100μl的终浓度。
14. 将细胞悬浮液（CFSE ^高和^低）（比例为1：1），并注射200μl混合物至OVA免疫， DPBS注射的小鼠。不要忘记注射一个幼稚的（以前没有注射，非免疫的）小鼠作为控制
15. 等待20-24小时。
第8天
1. 杀死受体小鼠，取出其脾脏，并将其放在Falcon 50管上的细胞滤器（40μm）上。机械地破坏脾脏（单独）以获得单细胞悬浮液，如步骤B1-3中所述用ACK缓冲液（2ml /脾）处理脾细胞。
2. 用DPBS 1x洗涤并离心（625×g，5分钟，室温）
3. 将沉淀重悬于1ml FACS缓冲液中
4. 计数细胞并重悬以获得5×10 7细胞/ml
5. 使用40μm细胞过滤器过滤（以避免FACS阻断）
6. FACS采集：在前向散射（FSC）对侧向散射（SSC）图上，在总脾细胞上的门细胞，然后当绘制CFSE（在FL-1，GFP或FITC通道） sup> + 细胞。在该门内，使用另一个CFSE对SSC图，区分CFSE ^高和CFSE ^低群体。获取10,000个CFSE ⁺事件（，即两个群体：CFSE ^高和^低）。对于所有分析的样品，总CFSE ⁺事件的数目应相同，以便更好地比较OVA免疫和未免疫的小鼠。如果无法达到10,000个事件，则可以获取5,000个事件，只要所有样本的最终数量相同即可。
数据分析
1. 为了分析获得后的FACS数据，通过使用以下门控策略来区分2个群体（CFSE ^高和CFSE ^高）：定义FSC上的脾细胞门和SSC，然后在排除双联体之后，选择总CFSE ⁺细胞。在CFSE ⁺单元格中，选通CFSE ^高和CFSE ^低，并确定（i）CFSE ^{/sup>在总CFSE ⁺细胞内的百分比和（ii）CFSE ^低在总CFSE}
2. 为了计算特异性裂解的百分比，与一个对照的"幼稚"未注射的小鼠相比，对每只小鼠（OVA或DPBS）或样品使用以下等式：
  ％特异性裂解= 100- [100×（％CFSE高/高免疫小鼠/％CFSE低/低免疫小鼠）/（％CFSE高//％CFSE ^低幼稚鼠标）。

代表数据

图1.体内杀伤试验的FACS分析的代表性点图。图1中的点图代表未免疫的对照小鼠（A），未免疫的幼稚小鼠（B）和OVA免疫的小鼠（C）中的CFSE染色（与侧散射，SSC）），然后对总CFSE细胞，如步骤C21和D22中详述的。对于每只小鼠指示CFSE ^高和CFSE ^低门，并且相应的百分比在每个门上方以粉红色显示。 CFSE ^高群代表用SIINFEKL肽脉冲的靶细胞，而CFSE ^低群代表不用任何肽脉冲的靶细胞。

用OVA蛋白（或用DPBS;未免疫的小鼠）免疫C57BL/6小鼠，7天后，它们接受来自C57BL/6小鼠的脾细胞的混合物，用SIINFEKL肽脉冲并用高浓度CFSE和未用肽脉冲的细胞，用低浓度的CFSE以1:1的比例染色。一天后，分离来自受体小鼠的脾细胞，并通过FACS分析以确定每只小鼠中CFSE高和高/低细胞的百分比（OVA免疫的小鼠图1C和图1B中的未免疫的小鼠）一个未注射的未注射小鼠用作上文详述的式中的"对照未处理小鼠"（图1A）（该小鼠在步骤B14中提及）。所有OVA免疫的（例如：图1C），但是也将初始DPBS注射的小鼠（aka未免疫的小鼠，例如：图1B）与该对照小鼠进行比较，以便定量和比较未免疫的小鼠和OVA免疫的小鼠在本实施例中，使用上面详述的公式，B中未免疫的小鼠的特异性裂解百分比计算如下：
％特异性裂解= 100- [100×（42.6/57.1）/（45/54.6）] ％特异性裂解= 100- [100×0.746/0.824] ％特异性裂解= 100- [100×0.905]
％特异性裂解= 100-90.5
％特异性裂解= 9.5
C中OVA免疫的小鼠的特异性裂解百分比计算如下：
％特异性裂解= 100- [100×（3.2/96.5）/（45/54.6）] ％特异性裂解= 100- [100×0.033/0.824] ％特异性裂解= 100- [100×0.040]
％特异性裂解= 100-4.0
％特异性裂解= 96
如实施例中所示，与设定在对照小鼠的幼稚非注射小鼠相比，计算每只小鼠的特异性裂解％。

笔记

该方案针对用Ova蛋白的接种和用激活CD8 +细胞毒性T细胞的相应的H-2限制性OVA肽的IVK测试进行了优化。该方案可适用于其他疫苗候选物及其具有CD8 + T细胞表位的相应肽。应优化各自的浓度。

食谱

FACS缓冲区
1x DPBS
5％胎牛血清或牛血清白蛋白

致谢

该协议改编自由Ligue Nationale Contrele Cancer（EquipeLabellisée，2014）资助的工作。 N. Chaoul由法国法兰西岛地区法兰西岛法兰西岛和法兰西基金会支持。

参考文献

Berraondo，P.，Nouze，C.，Preville，X.，Ladant，D.and Leclerc，C。（2007）。通过靶向免疫系统的先天性，适应性和调节性组分的tritherapy消除小鼠中的大肿瘤。（18）：8847-8855。

Chaoul，N.，Fayolle，C.，Desrues，B.，Oberkampf，M.，Tang，A.，Ladant，D。和Leclerc，C.（2015）。雷帕霉素损害抗肿瘤CD8 + sup/+ T细胞应答和疫苗诱导的肿瘤根除。/a> Cancer Res 75（16）：3279-3291

Dadaglio，G.，Fayolle，C.，Zhang，X.，Ryffel，B.，Oberkampf，M.，Felix，T.，Hervas-Stubbs，S.，Osicka，R.，Sebo，P.，Ladant，D 。和Leclerc，C。（2014）。抗原靶向对于与TLR4/TRIF信号传导相关的CD11b ⁺树突细胞，促进强的CD8 + T细胞应答。）：1787-1798。