材料和试剂

微量离心管（硅化聚丙烯，1.7ml）（Sigma-Aldrich，目录号：T3406-250EA）
Dynabeads Protein G（Thermo Fisher Scientific，Novex ^TM，目录号：10004D）
SYBR ^®绿色主混合（根据所使用的实时PCR系统进行选择）
蛋白酶混合物抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：04693116001）
37％甲醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号：F8775）
二（N-琥珀酰亚胺基）戊二酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：80424）
甘氨酸（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific ，目录号：10070150）
注意：20x甘氨酸储备液（2.5 M）的水溶液
无DNA酶的RNase A（ThermoFisher Scientific，目录号：EN0531）
蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^{TM，目录号：AM2546）}
8M氯化锂溶液（LiCl）（Sigma-Aldrich，目录号：L7026）
DynaMag -2磁体（Thermo Fisher Scientific，Novex ^TM，目录号：12321D）
DNA MinElute试剂盒（QIAGEN，目录号：28004）
组蛋白标记H3K9乙酰基抗体（Abcam plc，目录号：ab4441）
HA抗体（Abcam plc，目录号：ab9110）
SDS（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：798681）
Tris（TRIZMA）碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3608）
注意：250 mg/ml BSA储备水溶液
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
NP-40（Ipegal）（Sigma-Aldrich，目录号：I-3021）
Na-DOC（Sigma-Aldrich，目录号：D6750）
NaHCO 3（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
ChIP IP缓冲区（请参阅配方）
裂解缓冲液（见配方）
氯化锂（LiCl）洗涤缓冲液（见配方）
Tris-EDTA（TE）缓冲液（参见配方）
洗脱缓冲液（见配方）

设备

旋转轮
干热块
热固机（Eppendorf AG）
Nanodrop
水浴超声器（Diagenode，Bioruptor ）
实时PCR仪

程序

优化步骤
这4个步骤是至关重要的，并且需要准备工作以使该协议最佳地工作。
1. 对于每个使用的细胞系或组织，必须估计每100,000个细胞的染色质浓度。按照方案直到步骤C11并从步骤C28继续以逆转交联，在通过柱纯化样品之前用RNA酶A和蛋白酶K处理。用纳米滴测量DNA的浓度。
  注意：典型浓度为4-6ng /μl，NS-5细胞的染色质溶液产量为400-600ng /100μl。此信息将用于优化抗体浓度。
2. 每100,000个细胞中使用的抗体的浓度需要通过最初测试至少3种不同的抗体浓度来优化。如果抗体是商业的，这可以通过制定在制造商的数据表上给出的每μg染色质的最佳浓度和来自前一步骤的估计的染色质浓度来进行。否则，抗体浓度需要根据经验进行测试，直到达到有效的免疫沉淀为止。
  我们注意到免疫沉淀峰出现的最大抗体浓度（参见图1-2）。
3. 根据所使用的机器，需要优化超声处理时间。作为指导，在冰冷的水浴超声波仪中，我们超声400-500微升的最大10分钟（30秒开/30秒关闭最大功率）保持恒定的冰层。最佳超声处理的染色质如图3所示
4. 使用Primer3设计引物（ http://primer3.ut.ee ）并测试其通过基因组DNA的连续稀释的特异性。扩增子大小应在100至150bp之间
开始之前
1. 通过流式细胞术每μChIP平板或分选100,000个细胞，包括具有额外的细胞的模拟ChIP输入。注意：可以输入100,000个单元格（100％），也可以输入一小部分单元格，记住最终定量的百分比。
2. 重新悬挂Dynabeads ^®，并为预清除步骤和IP步骤占用足够的体积。在磁铁上捕获上清液，并在室温下在旋转轮上用1ml冰冷的ChIP IP缓冲液洗涤3分钟。重复2次，并重悬于具有相同体积的ChIP IP缓冲液中，最初从储备液中移出。将管放在4°C的旋转轮上，同时继续下一步
实验程序
对于平板细胞，脱离培养基并在室温下用1x PBS洗涤细胞。用足够体积的交联溶液直接在板上交联细胞以覆盖细胞。对于分选细胞，在分选期间使用硅化试管，将细胞沉淀（100×g 3分钟），用500ml PBS洗涤并在旋转轮（12rpm）上在1ml PBS中交联。
1. （可选）如果需要双交联，首先在室温下用PBS中的2mM Di（N-琥珀酰亚胺基）戊二酸酯交联45分钟，然后轻轻摇动，然后用PBS洗涤两次。
2. 用1％甲醛在PBS中交联10分钟，同时轻轻摇动
3. 用125mM甘氨酸淬灭固定，并在摇床上保持5-10分钟
4. 用冷PBS洗涤两次，在最后一次洗涤用移液管尽可能多的PBS。
5. 直接在平板上用100μl裂解缓冲液/100,000个细胞裂解细胞（，最少300μl以得到一个输入，一个模拟和一个ChIP样品;400μl，如果2种不同的蛋白质免疫沉淀）。 />
6. 用细胞刮刀收集细胞，并转移到硅化管中可选：在液氮中快速冷冻（某些抗体不需要此步骤，如组蛋白标记的抗体）。
7. 离开在冰上解冻。
8. 在水浴超声仪中用冰最多超声10分钟（见步骤A3）
9. 在4℃下以16,000×g离心5分钟，并将上清液转移到新的硅化管中。
10. 取等分试样（〜10μl），并在1％琼脂糖凝胶上运行以检查剪切（参见图3的最佳结果）。
  注意：确保染色质在500-1,000 bp之间，然后再继续或超声处理。
11. 在4℃下在旋转轮上用10μl洗涤的Dynabeads /100μl染色质溶液预清洁1小时。
12. 捕获磁铁上的珠，收集上清液到新的硅化管
13. 等分100微升在硅化管的输入，模拟ChIP和每个ChIP样品。
14. 向模拟和ChIP样品中加入400μlChIP IP缓冲液（SDS浓度必须降低至0.1％）。
  注意：请将输入样品保存在-20°C直到第二天。
15. 向稀释的模拟和ChIP样品中加入正确量的抗体，并在4℃下在轮子上旋转过夜注意：将剩余的洗过的珠子放在滚轮上过夜，使缓冲液中含有的BSA完全饱和。
16. 第二天早上，加入25μl饱和Dynabeads ^®，并在4°C下放回车轮2小时。
17. 在磁铁上捕获Dynabeads ，取出上清液并加入1ml冰冷的LiCl洗涤缓冲液。在室温下放置车轮3-5分钟，重复4次。
18. 用1ml冰冷的TE缓冲液洗涤1次。在放置磁铁之前尽快离心，尽可能地除去TE缓冲液。
19. 通过向洗涤的Dynabeads 直接加入50μl洗脱缓冲液洗脱抗体/染色质复合物。
20. 短暂涡旋。
21. 在室温下在热混合器上以1000rpm摇动至少15分钟
22. 在顶台离心机中以最大速度离心3分钟。
23. 将管放在磁铁上，收集上清液到新鲜的硅化管中
24. 重复洗脱步骤，并在同一管中合并洗脱液。
25. 解冻输入样品，并按照所有样品的后续步骤
26. 加入10μl5M NaCl（终浓度0.45μM）
27. 在干热块中煮沸样品15分钟以逆转交联。
28. 在室温下以最大速度旋转管30秒
29. 在加入1μl无DNA酶的RNase A之前，让管冷却
30. 在37℃下孵育15分钟。
31. 加入0.5μl蛋白酶K.
32. 在67℃孵育15分钟。
33. 用低DNA量的试剂盒（例如，DNA MinElute试剂盒）纯化DNA。
34. 通过与使用实时PCR系统和基于SYBR green的试剂盒进行定量的系列稀释的输入DNA产生的标准曲线进行比较，计算免疫沉淀DNA的量PCR（Frank等人，2001）。作为指导，我们使用每个反应1-2微升纯化的DNA，取决于目标蛋白和要分析的基因数量。沉淀的DNA的最终浓度根据靶蛋白而变化。在NS-5细胞中，我们获得了大约4ng /μl的内源性转录因子和高达30ng /μl的组蛋白标记。

代表数据

图1.小鼠皮质星形胶质细胞中组蛋白标记H3K9乙酰基与抗体量增加的μChIP。在Pax6启动子区（F：cggtgaaagaagccactagg）中进行实时PCR， R：agggaacacaccaactttcg）和在T细胞受体（TCR）的启动子区域（F：cttacaccccaaacctccaa，R：gggaggatgaggagaaaagg）。

图2.在递增量的抗体的NS-5细胞中过表达的HA标记的神经元素2的μChIP。使用识别Neurogenin2（Neurog2）靶基因的启动子区域的引物进行实时PCR （F：gtctcaggaccttcacagtag，R：gagcaaccttctccgtagtag）结合的Fbxw7（F：gcgctttgaagaaagacctg，R：gttttcaaggggcgaatgta）和ORF区域。
图3.在500μl裂解缓冲液中超声处理500,000星形胶质细胞10分钟（30秒开/30秒关闭）之后的最佳染色质溶液，设置H，Diagenode Bioruptor。运行两个样品（各10μl）在1％琼脂糖凝胶上与DNA梯子一起。

食谱

注意：在开始之前准备储备溶液中所有的新鲜溶液，并保持冰冻。

ChIP IP缓冲区
20 mM HEPES（pH 7.6）从1 M储备溶液中取出来自5M储备溶液的0.2M NaCl 2mM EDTA（pH8.0）从0.5M储备液中洗涤 0.1％Na-DOC，来自10％新鲜溶液 1％Triton X-100，来自10％新鲜溶液 5mg/ml BSA，来自250mg/ml储备溶液
补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒
裂解缓冲液
0.5％SDS从10％储备溶液中洗涤
10mM EDTA（pH8.0）从0.5M储备溶液中取出 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）从1 M储备溶液中取出补充1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒
氯化锂（LiCl）洗涤缓冲液
50mM HEPES（pH 7.6）从1μM储备溶液中取出 1mM EDTA（pH8.0）从0.5M储备溶液中取出 1％NP-40，来自10％新鲜溶液来自10％新鲜溶液的1％Na-DOC 0.5M LiCl，来自8M储备溶液
Tris-EDTA（TE）缓冲液
10mM Tris-HCl（pH8.0）从1μM储备溶液中取出1mM EDTA（pH8.0）从0.5M储备溶液中取出
洗脱缓冲液
50mM NaHCO 3（pH 5.2）从3M储备溶液中取出 1％SDS从10％储备溶液

致谢

这项工作是由来自Wellcome Trust（WT091800MA）的项目赠款和来自医学研究委员会（U117570528）到FG的授权赠款支持的。该方案使用来自Peggy Farnham的实验室的方法和由FrançoisGuillemot的实验室公布的方法建立。我们非常感谢Oishi大夫博士对稿件进行批判性阅读。

参考文献

Frank，SR，Schroeder，M.，Fernandez，P.，Taubert，S.and Amati，B。（2001）。 c-Myc与染色质的结合介导有丝分裂原诱导的组蛋白H4的乙酰化和基因激活。 Genes Dev 15 ）：2069-2082。

Masserdotti，G.，Gillotin，S.，Sutor，B.，Drechsel，D.，Irmler，M.，Jorgensen，HF，Sass，S.，Theis，FJ，Beckers，J.，Berninger，B.，Guillemot， F.和Gotz，M。（2015）。推理因素和REST的调节神经元重编程星形胶质细胞的转录机制。 Cell Stem Cell 17（1）：74-88。