材料和试剂

带有PTFE内衬酚醛帽的PYREX TM螺旋盖培养管（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-933D）
一次性玻璃移液管（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific ，目录号：13-678-20C）
具有预切帽的自动进样器小瓶（Sigma-Aldrich，目录号：29133-U）（Sigma-Aldrich，目录号：29494-U）
TLC硅胶60板（Merck）
1 ml注射器
注入回路
4-6周龄的拟南芥玫瑰花叶
注意：可以使用其他植物材料，可能需要额外的预防措施（见注释）。
异丙醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：A416）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
氯仿（Thermo Fisher Scientific，目录号：C607）
甲醇（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific ，目录号：A456）
乙酸
碘
普Prim素
丙酮
氮气
丁基化羟基甲苯（BHT）（Sigma-Aldrich，目录号：B1378）
7.5M乙酸铵溶液（NH 4 Ac）（Sigma-Aldrich，目录号：A2706）
磷脂（PL）标准[由Dr. Ruth Welti，（堪萨斯州立大学）提供]
注意：示例PL标准列表如表1所示。
单半乳糖基二酰基甘油（MGDG），氢化（Matreya，目录号：1058）
二半乳糖基二酰基甘油（DGDG），氢化（Matreya，目录号：1059）
注意：MGDG和DGDG标准物的实际组成需要通过实验确定，例如甲基化，然后进行GC分析（Politz et al。，2013）。
BHT的异丙醇溶液（参见配方）
脂质提取溶液（参见配方）
KCl溶液（见配方）
解决方案B（参见配方）
Galactolipid（GL）标准（见配方）
磷脂（PL）标准（参见配方）

设备

水浴（Thermo Fisher Scientific，型号：Isotemp2340）
水浴摇动器（Labnet International，型号：SWB5050）
氮气蒸发器N-EVAP（Organomation，型号：111）
通风橱
紫外光（360nm）
Oven（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific ，型号：13-247-650G）
带有TurboIonspray探针和HTC PAL自动进样器（LEAP Technologies）的API 4000 LC-MS/MS系统（AB SCIEX）

表1. PL标准列表示例

软件

分析者1.5.1（AB SCIEX）

程序

总脂质提取（图1）
1. 推荐将3 ml预热的异丙醇（75°C，0.01％BHT）放入玻璃管（50 ml，25 x 150 mm，配有Teflon内衬螺旋盖）中。
2. 收获新鲜的拟南芥叶，并立即在75℃水浴中在热异丙醇中浸泡至少15分钟以灭活磷脂酶D.为了实现更高的可靠性和重复性，5-30mg脱脂"干重"推荐在步骤A10中测量（?2-8完全发育叶开始）。温育后将样品冷却至室温。异丙醇处理的样品在室温下在一天内是稳定的
3. 向冷却的样品中加入1.5ml氯仿和0.6ml水，通过涡旋混合。将样品在室温，50rpm的水浴摇动器中孵育1小时
4. 用玻璃巴斯德移液管将提取的脂质（忽略电位相分离）转移到另一个玻璃收集管
5. 加入4毫升脂质提取液到叶片样品，并在25℃水浴摇床中孵育30分钟。将提取物转移到同一收集管。
6. 重复步骤A5，用脂质提取溶液提取样品，直到所有叶样品变白。建议提取每个样品相同的次数。通常需要5次萃取（包括步骤A2中的异丙醇）。老叶子更难完全提取，更长的孵化时间在步骤A2，A3和A5和更多的提取步骤可能有帮助。
7. 将1ml KCl溶液加入到合并的提取物（?20ml）中，通过涡旋充分混合，在?200×g离心10分钟，仔细弃去上层。
8. 加入2ml水，涡旋混合，以?200×g离心10分钟，仔细弃去上层。
9. 在氮气蒸发器中完全干燥脂质样品，温和加热（<50℃）可用于加速该过程。干燥的脂质可以在盖子密闭的情况下储存在-80℃。脂质的等分试样可以通过薄层色谱（TLC）拆分用于质量检查（图2）。简言之，将对应于约0.2-1mg DW的总脂质点在TLC硅胶60板上，并通过氯仿：甲醇：乙酸:H 2 O = 85:15:12.5:3.5拆分。将板在通风橱中完全干燥，然后通过碘蒸气染色并用丙酮/H 2 O（60:40; v/v）中的0.01％甘草碱检查，并检查板紫外线（360nm）光
10. 干提取叶在105℃的烘箱中过夜。称重以获得"干重"
通过ESI-MS/MS和数据处理进行脂质谱分析
1. 在氯仿中重构干燥的脂质样品（步骤A9），在使用前盖紧以避免蒸发。为了容易的样品制备，将脂质样品根据干重稀释至相同的浓度。我们通常使用250微升氯仿/毫克干重
2. 每个样品包含840μl溶液B，5μlPL标准品，3μlGL标准品和脂质样品，对应于0.1-0.2mg干重（25-50μl），在2ml快速封口自动进样器小瓶中加入氯仿至1,200μl，带预切小瓶盖。
3. 对于每10个脂质样品，一个"内标（IS）"仅用于机器校正/污染控制。使用氯仿代替该小瓶中的脂质样品
4. 以下列格式加载自动进样器：IS1，sample1-10，IS2，sample11-20等。在不同基因型之间推荐"空白"样品，其仅含有溶液B和氯仿
5. 通过ESI-MS/MS分析脂质样品。详细信息可以在Welti等人的（2002）中找到。我们在API 4000上使用的参数在第C节中列出。在不同的设置上需要优化，以便在较旧或较新的机器上调整更少或更多的参数。附着代表性的磷脂酰乙醇胺（PE）分析结果（图3）
6. 数据由Analyst 1.5.1提取，必要的校正，包括背景扣除和平滑。对于每种脂类，使用多种（通常为2种）新型脂质作为内标（表1），根据每种脂质的分子量的线性内插用于内标峰面积归一化。根据与标准化内标峰面积比较的样品峰面积计算每种脂质种类的量。推荐使用五个或更多的生物学重复，使用学生t检验进行统计分析
7. 脂质数据可以表示为绝对量（nmol/mg"干重"，推荐）或总脂质（PL和GL）的百分比。
API 4000上的脂质分析参数
配备有TurboIonSpray探针和HTC PAL自动进样器的API 4000 LC-MS/MS系统用于脂质分析。源温度为100℃，界面加热器开启，离子喷雾电压设定为5.5kV，氮气用于源气和帘幕气。扫描分辨率设置为0.1Da。使用具有1ml注射器和注射环的自动进样器引入样品用于全脂质分析。通过以0.03ml/min直接注入将样品提供给TurboIonSpray探针。每种类脂的扫描参数列于表2中
表2.扫描参数

代表数据

图1.脂质提取工作流程示意图。 1,000 rpm（?200 x g ）。

图2.磷脂的TLC分离。在A部分提取的脂质可以在TLC板上分离。这里使用的流动相是氯仿：甲醇：乙酸:H 2 O = 85:15:12.5:3.5（v/v）。

图3.代表性MS数据。A.在不同时期分析不同的脂质类型。期间1用于控制目的，不用于计算。 B.IS样品中的PE曲线。 C.植物样品中的PE谱。 D.植物PE物种的放大视图。

笔记

这种方法可以很容易适应根，花，茎和整个长角果。

对于拟南芥种子样品，"干重"的可重复性高度依赖于转移脂质提取物期间的种子阶段和样品损失。在这种情况下，建议使用百分比归一化。
对于难以完全提取的材料，建议在提取前在液氮中进行组织破坏。在这种情况下，每次在转移脂质提取物之前需要离心步骤（例如，，?200×g×10分钟，10分钟）。

食谱

用BHT的异丙醇溶液
0.01％（w/v）BHT（?0.5mM）在75°C预热
注意：在室温下稳定
脂质提取液
氯仿：甲醇= 2:1（v/v），用0.01％BHT洗脱注意：如果在室温下盖紧，则稳定
KCl溶液
1 M KCl
注意：在室温下稳定
解决方案B
甲醇：NH 4 Ac（300mM）= 20:1（v/v）注意：在室温下稳定
Galactolipid（GL）标准
注意：存放于-80°C，使用前请彻底融化并混匀
在氯仿：甲醇:H 2 O = 35:65:8 [（v/v）或接近]中稀释。
MGDG（?0.5nmol /μl）
DGDG（?0.25nmol /μl）
磷脂（PL）标准
注意：存放于-80°C，使用前请彻底融化并混匀
在氯仿：甲醇:H 2 O = 35:65:8 [（v/v）或接近]中稀释。
PL标准内容的示例参见表1

致谢

该方案改编自Welti等人（2002）。 Welti博士还提供脂质标准，数据处理和分析方面的帮助。工作由美国能源部（DOE）Grant DE-AR0000202和国家科学基金会拨款MCB- 1412901 和DBI- 1427621 。

参考文献

Politz，M.，Lennen，R。和Pfleger，B。（2013）。分析膜脂质在植物胁迫反应中的作用。磷脂酶Dα在拟南芥中的冷冻诱导的脂质变化中的作用。

J Biol Chem 277（35）：31994-32002。