材料和试剂

玻璃管[具有PTFE内衬酚醛帽的PYREX 螺旋盖培养管（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific ，目录号：14-932H）]
移液管100-1000μl（Eppendorf Research 2100）
Axygen ^TM1,000μl通用移液管吸头（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific ^TM，目录号：14-222-690）
总植物脂质
注意：由相同作者（Liu和Wang，2016）和原始出版物（Welti等人，2002）在伴随脂质提取和分析方案中描述的方法提取。
氯仿（Thermo Fisher Scientific，目录号：C607）
来自蜂蜜蜂毒液（Sigma-Aldrich，目录号：P9279）的PLA 2
注意：在使用前溶解在反应缓冲液中1单位/μl。
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
氮气
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C8106）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
甲醇（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific ，目录号：A456）
反应缓冲液（参见配方）
NaCl溶液（见配方）
提取溶液（见配方）

设备

氮气蒸发器N-EVAP（Meyer Organomation，型号：111）
具有以30％功率工作的探头的超声处理器（GEX 130PB）或类似设备[例如，超声波处理器（Cole-parmer，型号：EW-04714-51）]
孵育器（Thermo Fisher Scientific，型号：Isotemp 537D）或类似设备[例如，微生物培养箱（Thermo Fisher Scientific，Isotemp ^{TM，目录号：15-103-0513 ）]}

程序

通过氯仿重建总植物脂质，并将对应于0.2mg干重的脂质的量等分在玻璃管中。在步骤9中将使用相同量的未处理的脂质样品作为对照
将脂质在氮气蒸发器中彻底干燥（> 30分钟），可以使用温和加热（<50℃）以加速该过程。
干燥的脂质在500μl反应缓冲液中在室温下水合≥10分钟，随后超声（30％功率，在冰上）以均匀地分散脂质。
将10单位（10μl）的PLA 2加入到反应中，通过涡旋混合。将反应混合物在37℃下孵育2小时以完全消化磷脂
向混合物中加入500μl500mM NaCl以促进相分离。加入2ml提取溶液并涡旋以终止反应并提取脂质
以?200×g离心10分钟。将底部（有机）相转移到另一个玻璃管
加入1ml氯仿，重复步骤6，两次完全萃取
在氮气下干燥提取的脂质，在50μl氯仿中重构脂质
使用对应于0.2mg干重的总脂质作为对照，在质谱中描述消化和未消化脂质，如同一作者的伴随脂质提取和分析方案中所述（Liu和Wang，2016）。推荐三个或更多个生物学重复，并且使用Student's t检验进行统计分析。比较未消化样品中的常规脂质和消化样品中的溶血脂质，以确定不同脂质类别中脂肪酸的位置/组成。对于除了磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE）之外的更多的定量结果和更多的磷脂类，脂质样品可以首先通过薄层色谱法（TLC）拆分（参见Liu等人的 2015），并且每个脂质/溶血脂点可以通过转甲基化和GC分析来定量（Politz等人，2013）。

代表数据

来自Liu等人的代表性数据，2015（图1）。总脂质通过PLA 2消化，然后通过质谱法分析PC和LysoPC。与野生型相比，消化样品中LPC16的增加和RNAi品系中未消化样品的PC34的增加是相似的，表明RNAi品系中增加的PC34具有酯化到sn-1位的C16脂肪酸源于真核生物途径

图1.磷脂酰胆碱（PC）中脂肪酰基链位置/组成的分析。 A。在来自两个AAPT TM RNAi系和WT植物的脂质的PLA 2处理后，具有C16和C18脂肪酸的LysoPC的含量。 B.来自两个AAPT RNAi系和WT植物的脂质的具有C34和C36脂肪酸而不进行PLA 2处理的PC的含量。 *和**分别基于学生的t检验，分别在P <0.05和P <0.01时WT和突变体之间的差异。值为平均值±SD（n = 3）。

食谱

反应缓冲液
100mM HEPES，pH7.4 10mM CaCl 2
10mM MgCl 2/
注意：室温稳定
NaCl溶液。
500 mM NaCl
注意：室温稳定
提取溶液
66.7％（v/v）氯仿
33.3％（v/v）甲醇
注意：使用之前

致谢

该协议改编自Williams的工作，1995。工作由国家食品和农业研究所授予日期7067013-24429和美国能源部（DOE）Grant DE支持-AR0000202。

参考文献

Liu，Y。和Wang，X.（2016）。提取和剖析植物极性甘油脂质。生物协议 6（12）：e1849。
Liu，Y.，Wang，G.and Wang，X.（2015）。氨基醇磷酸转移酶1和2在磷脂稳态中的作用拟南芥植物细胞 27（5）：1512-1528。 >
Ohlrogge，J。和Browse，J.（1995）。脂质生物合成。植物细胞 7（7）：957-970。
Politz，M.，Lennen，R。和Pfleger，B。（2013）。通过提取和甲基化定量细菌脂肪酸。生物协议 3（21）：e950。
Williams，JP，Khan，MU和Wong，D。（1995）。使用脂肪酶和磷脂酶A2分析脂肪酸在二 - 和三酰基甘油上的位置分布的简单技术。 J Lipid Res 36（6）：1407-1412。
Welti，R.，Li，W.，Li，M.，Sang，Y.，Biesiada，H.，Zhou，HE，Rajashekar，CB，Williams，TDand Wang，X。（2002） ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12077151"target ="_ blank">分析膜脂质在植物胁迫反应中的作用。磷脂酶Dα在拟南芥中的冷冻诱导的脂质变化中的作用。

J Biol Chem 277（35）：31994-32002。