材料和试剂

96孔超低细胞粘附板，Lipidure-Coat（Amsbio LLC，目录号：AMS.51011610）或PrimeSurface 96U板（Sumitomo Bakelite，目录号：MS-9096U）
6孔超低细胞粘附板（Thermo Fisher Scientific，Corning ^TM，目录号：07-200-601）。
100mm细胞培养皿（Corning，BD Falcon ，目录号：353003）
玻璃巴斯德吸液管
小鼠胚胎干细胞（mESC）或小鼠诱导多能干细胞（miPSC）
磷酸盐缓冲液（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10010-023）
水，细胞培养级（Thermo Fisher Scientific，目录号：15230-162）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）高葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10564-011）
格拉斯哥MEM（GMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11710-035）
Dulbecco改良的Eagle's培养基/营养F-12 Ham（DMEM/F12 Ham）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10565-018）}
胎牛血清（FBS），ESC Qualified（Thermo Fisher Scientific，目录号：10439-024）
敲除血清置换（KSR）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10828-028）
青霉素和链霉素（Pen/Strep）（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：15140-122）的混合物
白血病抑制因子（LIF）（Merck Millipore Corporation，目录号：ESG1107）
GSK3b抑制剂（Stemolecule CHIR99021）（Stemgent，目录号：04-0004-02）
MAPK/ERK抑制剂（Stemolecule PD0325901）（Stemgent，目录号：04-0006-02）
TrypLE Trypsin Replacement（Thermo Fisher Scientific，目录号：12605-028）
10mM非必需氨基酸（NEAA）溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11140-050）}
丙酮酸钠溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11360-070）
2-巯基乙醇（2-ME）（Sigma-Aldrich，目录号：M7522）
生长因子减少Matrigel （GFR Matrigel）（Corining ，目录号：356230）
B27补充物（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：17504044）
N2补充（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：17502-048）
全反式视黄酸（Sigma-Aldrich，目录号：R2625-50MG）
牛磺酸（Sigma-Aldrich，目录号：T-8691）
MEF介质（参见配方）
LIF + 2i介质（见配方）
视网膜分化培养基（RD培养基）（参见配方）
汤姆的媒介（见食谱）

设备

孵育器（37℃和5％CO 2）（Thermo Scientific，型号：HERACell 150i）
离心机（Eppendorf，型号：Conical centrifuge 5702）
组织培养罩，B2型生物安全柜（Thermo Scientific，型号：1300系列II类）
血细胞计数器（Neubauer室）或等效方法
倒置显微镜（Leica，型号：DMi8）

程序

涂层板
1. 通过将管浸没在冰中1小时来解冻生长因子减少基质胶的等分试样。
2. 在冷MEF培养基中稀释基质胶1:50，将培养基和Matrigel转移到TC培养皿中。对于6孔板，我们使用1ml /孔和7ml用于10cm板。
3. 在37℃孵育至少1小时。
注意：因为Matrigel在温暖的温度下固化，所以应始终保持在冰上，我们建议使用预冷却的吸头。
mESCs的维护
1. 将mESC接种在用LIF + 2i培养基预涂覆有生长因子减少基质胶的10cm培养皿上。
2. 然后将mESCs在37℃下在5％CO 2培养箱中孵育，直到传代或视网膜分化。
3. 每隔一天更换一次注意：应该特别注意避免mESCs在维持培养中的过度融合，因为它可能导致细胞的有害分化。
来自未分化mESCs的视网膜细胞的生成
1. 从未分化的mESC的50％汇合板（至少四个通道离开饲养层，图1）除去培养基，并添加TrypLE胰蛋白酶替换到细胞。将细胞放回培养箱中3-5分钟，直到mESCs菌落开始提起。由于TrypLE胰蛋白酶替换不被培养基中的血清抑制，该方法不需要用PBS预洗涤。
2. 加入5毫升MEF媒体板和轻轻地脱离细胞用玻璃巴斯德吸管。观察细胞从培养板中取出并用移液管上下移动以获得单细胞悬浮液，小心避免气泡。
  
  图1.显示了未分化的mESCs（第0天）的典型形态。显示了无饲料的未分化的R1 mESC（最初由Andras Nagy产生）。比例尺：500μm（A）和250μm（B）
3. mESC细胞在190×g下沉淀5分钟
4. 使用5ml视网膜分化培养基（RD培养基）小心地分散沉淀
5. 使用血细胞计数器（Neubauer chamber）或等效方法计数细胞密度。
6. 将3000个细胞/100μl在96孔低附着板（100μl/孔）的RD培养基中。细胞聚集体（胚胎体）应在不到12小时内形成。培养开始的日期被指定为第0天。
7. 24小时后（第1天），加入生长因子减少的基质胶至终浓度为2％（vol/vol）。商业Matrigel产品的批次间变异性可以改变视网膜诱导的效率;我们优选使用相对高浓度（> 9.5mg/ml）之一。我们建议在冷RD培养基中稀释Matrigel 1:10，加入20μl稀释液/孔。
8. 在第3天，清楚的神经上皮细胞层是明显的（图2）注意：不同的细胞系可能以不同的速率生长，因此每孔的初始细胞数可能需要调整。我们发现，对于大多数测试的线，3,000-5,000个细胞/孔是最佳的细胞密度。
  
  图2.在不同分化阶段的类胚体的典型形态。使用本文所述的方法分化R1 mESC。在每个EB（胚状体）周围，从第3天（D-F）开始形成清晰的神经上皮层，并且从第5天开始，该层显着（G-K），视觉囊泡和视杯样结构从第7-8天（L-O）比例尺：150μm 注意：在第13天（O和P中的红色箭头）后观察到视网膜色素上皮（RPE）细胞。
视网膜成熟
1. 在第7天，将胚状体（EB）转移到补充有B27和N2的Tom's培养基中的6孔低附着板以促进神经元分化。从第7天起，每隔一天更换一次培养基
2. 从第10天到第15天，除了B27和N2之外，Tom's培养基还补充有0.5μM类视黄酸和1mM牛磺酸。 RPE细胞从第13天（图2）显而易见
3. 从第15天开始，将EB保持在汤姆氏培养基中。从第24天和第35天后检测到视紫红质+杆感光细胞，EB显示成熟视网膜的所有层。

食谱

MEF培养基（100ml） 89 ml DMEM
10ml FBS
1 ml Pen/Strep
LIF + 2i培养基（100ml） 90ml MEF培养基
10ml FBS
1ml丙酮酸钠 100μl2-ME（储备0.1M）
100μlLIF（库存1000万单位/ml）
在使用当天，补充3μMGSK3β抑制剂干细胞CHIR99021和0.4μMMEK抑制剂干细胞PD0325901
2-ME（每月准备）
35μl2-ME
5ml蒸馏水
视网膜分化（RD）培养基（100ml）
96.4ml格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）
1.5 ml KSR
1 ml非必需氨基酸（原液100x）
1 ml丙酮酸钠（储备液100x）
100μl2-ME（原液0.1M）
汤姆的中等（100毫升）
98 ml DMEM：F12
1 ml非必需氨基酸（原液100x）
1 ml丙酮酸钠（储备液100x）
- 从第7天到第15天：
1 ml N2（储备100x）
2 ml B27（原液50x）
- 从第10天到第15天：
0.5μM类视黄酸（1mM储备液） 1mM牛磺酸（原液1M）

致谢

该协议最初是作为：La Torre 等人的一部分发布的。（2015）。作者要感谢Reh和Bermingham-McDonogh实验室的所有现任和前任成员进行了许多有益的讨论。特别感谢Tom Reh和Akina Hoshino提供宝贵的帮助和建议，以及NIH 1 PO1 GM081619和华盛顿大学P30EY01730（PI：Reh）的Vision Core Grant的成像核心。

参考文献

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Eiraku，M。和Sasai，Y。（2012）。小鼠胚胎干细胞培养物用于产生三维视网膜和皮质组织。 Nat Protoc 7（1）：69-79。

Kamiya，D.，Banno，S.，Sasai，N.，Ohgushi，M.，Inomata，H.，Watanabe，K.，Kawada，M.，Yakura，R.，Kiyonari，H.，Nakao， Jakt，LM，Nishikawa，S。和Sasai，Y。（2011）。胚胎干细胞分化成神经祖细胞的内在转换。
470（7335）：503-509。

La Torre，A.，Hoshino，A.，Cavanaugh，C.，Ware，CB和Reh，TA（2015）。 GIPC1-Akt1通路是小鼠胚胎干细胞中的眼球规格所需的。干细胞 33 9）：2674-2685。

Nakano，T.，Ando，S.，Takata，N.，Kawada，M.，Muguruma，K.，Sekiguchi，K.，Saito，K.，Yonemura，S.，Eiraku，M.and Sasai， 2012）。视杯自我形成和可存储的分层来自人类ESC的神经视网膜。细胞干细胞 10（6）：771-785。