材料和试剂

10cm培养皿（Thermo Scientific，目录号：172931）
24孔板（Thermo Scientific，目录号：142475）
2 ml和5 ml一次性灭菌注射器
Sprague-Dawley 4周龄大鼠（浙江中医药大学动物中心）
生长因子减少的基质胶（Corning，目录号：354230）
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 1g/L glucose glutamine&丙酮酸钠（Mediatech，目录号：10-014-CV）
胎牛血清（Biological Industries，目录号：04-001-1A）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Shanghai ji'nuo，目录号：GNM 20012）
水合氯化物（国耀化学试剂有限公司，目录号：30037517）
70％乙醇
中等（见配方）
4％水合氯醛（见配方）

设备

外科剪刀，手术刀和镊子
标尺
37℃，5％CO 2细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：51026334）中。
倒置显微镜（Leica Microsystems，型号：DMi1）
电子秤

软件

Image-Pro Plus 6.0

程序

注意：整个实验应在无菌条件下，包括所有材料和试剂。所有操作均应无菌。

允许生长因子减少基质胶融化过夜从-20°C至4°C在冰箱中。
将24孔板和移液器吸头在-20°C冷却过夜。
使用电子秤称重大鼠。
使用5ml一次性灭菌注射器向大鼠的腹部注射4％水合氯醛，每100克1ml水合氯醛至麻醉大鼠，然后通过颈椎脱位处死动物，将大鼠置于动物手术无菌处。
喷雾70％乙醇大鼠的皮肤和捆绑的大鼠。
使用剪刀打开胸部，清除其他器官以暴露胸主动脉（图1和图2）。

图1.将大鼠置于动物手术无菌状态

图2.打开胸部并摘除其他器官以暴露胸主动脉
使用镊子和剪刀分离脊柱和主动脉（图3）。

图3.使用镊子和剪刀分开脊柱和主动脉
切开主动脉从膈膜到心脏的末端，然后放在10厘米的菜，用无菌PBS在室温下洗涤主动脉（图4）。

图4.将主动脉从膈膜切割到心脏末端
小心清洁周围的组织主动脉（图5）。

图5.清洁主动脉周围的周围组织
使用手术刀将主动脉切成由标尺测量的1mm长的环（图6）。

图6.使用手术刀将主动脉切成由标尺
测量的1 mm长的环
保持生长因子减少matrigel在冰上。然后在生物安全柜的24孔板中的每个孔中加入150μl基质胶。每组三个复合井。
注意：
1. 基质胶应该小心和快速。它很容易在室温下固化。
2. 将基质胶置于冰上，然后将其加入孔中，但板不需要放在冰上，板应在添加基质胶之前冷冻。
3. 添加基质胶后轻轻摇动平板以确保整个表面被matrigel覆盖。如果孔中有一些气泡，请使用2 ml灭菌注射器将其破坏。
轻轻摇动板，然后将其在普通加湿培养箱中30分钟（37℃）。
将1 mm主动脉环放在每个孔的中间。
然后在普通加湿培养箱（37℃）中孵育约10分钟。
添加另外150微升基质胶到孔中以覆盖环。
然后再在普通加湿培养箱（37℃）中孵育30分钟。
作为嵌入基质胶中的主动脉环，然后加入200μl含有10％胎牛血清的Dulbecco氏改良Eagle's培养基/孔，最后将24孔板置于培养箱（37℃）（图7）中（图7）

图7.在24孔板中被培养基覆盖的基质胶中的主动脉环
每2天更新一次培养基。
7天后，在显微镜下观察血管分支（图8）

图8. 7天后，通过显微镜观察血管分支。比例尺，100μm。
使用Image-Pro Plus 6.0检测出芽长度和范围。
使用Image-Pro Plus 6.0软件对每个环计算总容器生长。计算每个环的所有分支的总长度，以便我们可以在组内比较它们

笔记

在这个协议中，我们只使用一种培养基（普通培养基）培养。
学生还可以收集不同种类的条件媒体来制作多个组。通常我们设置几组，以比较在主动脉环上工作的不同上清液。
当你有几个组，你需要为每个组设置三个复杂的井

食谱

中等
90％Dulbecco's Eagle's Medium修改
10％胎牛血清
4％水合氯化
0.4克水合氯化锌 10ml去离子水

致谢

我们感谢Han em等人。对于先前在"血管生成"2012年发表的主动脉环测定方法的技术建议。这项工作由中国国家自然科学基金会（No.31171418,81320108003,31371498，JW，No.81170308,81370247 XYH，No.81202948浙江省科技厅（No.2013C37054），中国国家基础研究计划（973计划，国家自然科学基金资助项目），国家高技术研究发展计划（No.2013AA020101）浙江省重点科技项目（2012C13013-3），，县国家自然科学基金（浙江省自然科学基金（No.81573641），浙江省自然科学基金（浙江省自然科学基金重点项目）。

参考文献

Han，Y.，Yang，K.，Proweller，A.，Zhou，G.，Jain，MK和Ramirez-Bergeron，DL（2012）。抑制ARNT严重损害内皮细胞存活力和中度缺氧反应的功能。血管生成 15 （3）：409-420。