材料和试剂

60-mm无菌培养皿（例如，BD Biosciences，Falcon ，目录号：353002）。
注意：目前，"Corning，Falcon ^? ，目录号：353002"。
T-75组织培养瓶（例如BD Biosciences，Falcon ，目录号：353136）。
注意：目前，它是"康宁，Falcon ^? ，目录号：353136"。
50ml无菌锥形管（例如BD Biosciences，Falcon ，目录号：352070）。
注意：目前，"Corning，Falcon ^? ，目录号：352070"。
384孔微孔板（例如，BioExpress，目录号：T-6062-1）
1.7ml无RNase，无DNA酶的Posi-Click管（Denville Scientific Inc.，目录号：C2170）
小鼠野生型（WT）和TTP缺陷型稳定成纤维细胞细胞系（Lai WS等人，2006）
1x不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS）
0.05％胰蛋白酶/EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25300）
定义的胎牛血清（FBS）（GE Healthcare，HyClone ，目录号：SH30070.03）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11965-092）
青霉素 - 链霉素10,000U/ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：15140-122）
L-谷氨酰胺200mM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25030-081）
重组小鼠肿瘤坏死因子（TNF）（R& D Systems，目录号：410-MT）
放线菌素D（Sigma-Aldrich，目录号：A4262）
Illustra RNAspin MiniRNA分离试剂盒（Sigma-Aldrich，GE Healthcare，目录号：25-0500-72）
SuperScript First-Strand Synthesis System（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：18080-051）
Power SYBR Green master mix（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^TM，目录号：4368702）
巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
DEPC水（Baltimore Bioworks，目录号：WA-137-500）
感兴趣的抄本的入门
70％乙醇
完整介质（见配方）
血清饥饿培养基（见配方）

设备

37℃，5％CO 2强制空气培养箱（例如Thermo Fisher Scientific，Forma TM sup），型号：3110） >
带有摆动斗式转子的离心机和适用于50 ml锥形管的适配器
ABI Prism 7900HT实时PCR系统和序列检测系统（Applied Biosystems，型号：7900HT）或类似物
Vortex-Genie-2（Scientific Industries，目录号：SI-0236）或类似的
Nanodrop 2000c分光光度计（Thermo Scientific，型号：2000c）
桌面离心机（，例如，Eppendorf，型号：5417R）
DNA Engine Peltier热循环仪（Bio-Rad Laboratories，MJ research，目录号：PTC-200）或类似物
细胞刮刀（Corning，Costar，目录号：3010）

软件

GraphPad Prism软件（GraphPad Software，型号：6.0版）

程序

细胞培养
1. 如先前所述（Lai WS等人，2006），小鼠稳定的成纤维细胞系衍生自来自E14.5TTP KO和同窝出生的WT胚胎的MEF培养物。这些稳定的细胞系已经培养超过200代，并且在生长速率，形态学和快速诱导基因（例如Fos ）对血清刺激的反应方面很好地匹配。
2. 将两种稳定的成纤维细胞系保持在T-75烧瓶中的完全培养基中，并在达到约70-80％汇合和胰蛋白酶处理后每2-3天传代。
  注意：细胞培养，刺激和放线菌素D处理在II类生物安全柜中进行。
血清饥饿和刺激
1. 为了将细胞平板用于实验，在用10ml PBS洗涤后，从3-5个T-75烧瓶中收获细胞，然后用2ml胰蛋白酶/EDTA胰蛋白酶化，并用每个T-75烧瓶中的8ml完全培养基中和，并在每个培养皿5ml培养基中以2-3×10 5个细胞的密度接种到60-mm培养皿中。
  注意：对于66KO和67WT稳定，从每个T-75瓶收获的估计的细胞计数范围为8×10 5至3×10 6个/细胞系，平均产量约为1.4×10 6个细胞。
2. 当细胞达到70-80％汇合时，在无血清DMEM中洗涤细胞，然后在5ml血清饥饿培养基中培养至少16小时的血清饥饿。
3. 将重组鼠TNF（或其他刺激物）加入血清饥饿培养基中，最终TNF浓度为10ng/ml，然后在处理后的不同时间点收集细胞。
放线菌素D处理
1. 放线菌素D溶液通过将粉末溶解在DEPC水中制备。将溶液在4℃下在黑暗中储存，最终浓度为2-5mg/ml。
  注意：放线菌素D在4℃下完全溶解于水中通常需要至少1-2天;在使用前轻轻倒置瓶子几次以混合溶液。在本协议中，DMSO不用作溶剂。
2. 在30分钟或其他时间的TNF处理成纤维细胞（在该实施例中为10ng/ml）或用其它刺激物处理后，将放线菌素D直接加入到血清饥饿培养基中，最终浓度为5-10μg/ml ; TNF和其他刺激在加入放线菌素D时不被除去。
  注意：我们常规地对单个刺激执行时间过程研究以确定感兴趣的基因的动力学表达模式。然后通常选择细胞表达感兴趣的转录物的最高水平的时间点作为放线菌素D加入的时间。
3. 然后在加入放线菌素D后0,10,20,30,45,60,90和120分钟或如所示的其它时间收获细胞;每个样品由来自三个60-mm培养皿的合并细胞组成注意：不建议使用胰蛋白酶/EDTA进行细胞收获，然后进行RNA提取。有必要立即进行程序D，在用冰冷的PBS冲洗后，将样品裂解缓冲液直接加入培养皿中。
RNA提取，逆转录和半定量实时PCR
1. 为了制备用于RNA提取的细胞，吸出培养基，并将细胞在每个60-mm培养皿中的5ml冰冷PBS中洗涤一次。将补充有新鲜添加的巯基乙醇（ME，1:100稀释）的RA1裂解缓冲液（来自Illustra RNAspin MiniRNA分离试剂盒）直接加入培养皿中，然后使用细胞刮刀刮下裂解物。然后从一式三份板中收集裂解物，并转移到新鲜的1.7ml微量离心管中。该程序可以在室温下在台上进行。
  注意：对于除了粘附细胞（例如成纤维细胞）以外的悬浮细胞，首先通过离心收集样品，然后在加入含ME的RA1裂解缓冲液之前在PBS中洗涤一次。
2. 按照制造商在GE Healthcare illustra RNAspin MiniRNA分离试剂盒中的说明进行总RNA提取;这包括裂解物涡旋，通过切碎机柱过滤以降低裂解物的粘度，以及使用无RNA酶的DNase I进行柱上消化的步骤。已经流过切碎机柱的裂解物可以转移到新管中并储存在 - 80℃。
3. 从每个样品中取1μl的RNA，以检查RNA的数量和质量与Nanodrop 注意：在该方案中来自三个组合培养皿的预期RNA产量为约16μg。
4. 使用oligo（dT）Sub 12-18引物和SuperScript III Reverse Transcriptase（Invitrogen）根据制造商的方案使用750ng RNA合成第一链cDNA。
5. 然后用DEPC水将cDNA稀释至1.5-2ng /μl，即可使用，或可在-20℃下保存。
6. 使用SYBR Green主混合物和ABI Prism 7900序列检测系统在384孔板中进行实时PCR。每个反应由总共10μl反应体积的1x SYBR Green主混合物，1-2ng cDNA，250nM每种引物，5μl2x SYBR Green master mix，0.5μl μl的每种正向和反向引物（5μM），1μlcDNA和3μlDEPC水/反应。每个板含有单个转录物的"无模板"对照，以及每个样品作为内部对照的管理转录物例如Actb mRNA。
7. 使用ΔΔCt方法分析结果（Pfaffl MW 2001）。首先将来自一式两份或三份样品的Ct值归一化为它们各自的内部管家转录物，在该实施例中为Actb mRNA，然后在加入放线菌素D之前归一化为它们各自的样品，其设置为1.结果表示为mRNA丰度相对于时间0.代表性实验显示在表1中注意：在使用前验证引物扩增效率和特异性是至关重要的。为了检查引物扩增效率，使用跨越4-5个对数范围的cDNA的10倍连续稀释。将内部管家转录物归一化后的相对Ct值对线性回归曲线的对数值的浓度作图。当小于或等于0.1的斜率的任何绝对值在测定中与管家基因配对时，被认为通过效率测试。代表性实验如图1所示。
  
  表1.使用ΔΔCt方法计算相对转录丰度
  
  *ΔCt= Ct（Fos，column 2） - Ave Ct（Actb，column 4）; **ΔΔCt=ΔCt（第5列）-AveΔCt在时间0（第6列）。在TNF刺激30分钟后加入放线菌素D（ActD）
8. 然后使用GraphPad Prism软件基于非线性拟合单相指数衰减曲线计算转录物转换率，并且通常表示为每个实验的50％mRNA衰减的时间。一个代表性的实验如图2所示

代表数据

图1.实时PCR引物的验证制备在10,5,1,0.5,0.1和0.01ng的cDNA的系列稀释液作为模板，用于实时PCR分析，使用针对Fos的引物和Actb转录物。所示图中的X轴是cDNA的对数值;在Y轴上显示的ΔCt是在Fos 和 Actb mRNA之间的Ct值的差异。呈现的数据是来自一个代表性实验的重复的平均值±SD。绘制线性回归曲线，绝对斜率值≤0.1。在该实施例中，0.01ng时Fos转录物的Ct值不可检测，因此不包括在回归曲线的计算中。

图2.在存在和不存在TTP的情况下TNF刺激后Fos和Cxcl1转录物的稳定性。在血清饥饿的成纤维细胞系的TNF处理30分钟后加入放线菌素D以抑制转录。在指定的时间收获细胞用于总RNA提取，并且用实时RT-PCR测量mRNA水平。将转录物浓度相对于Actb转录物的浓度标准化，并且在加入放线菌素D之前以TNF处理的样品中的丰度分数表示。所示结果是来自一个代表性实验的重复样品的平均值。使用GraphPad软件（红色虚线，66KO细胞;蓝色虚线，67个WT细胞）基于非线性拟合单相指数衰减曲线计算转录物转换率，并且表达为每次50％mRNA衰减的时间实验（当50％mRNA衰减线的黑色虚线分别与每条曲线的红色和蓝色虚线交叉时的时间点）。

食谱

完成媒介
DMEM
10％FBS
1％Pen-Strep
2mM谷氨酰胺
血清饥饿培养基
DMEM
0.5％FBS
1％Pen-Strep
2mM谷氨酰胺

致谢

该方案改编自先前公开的研究，Lai等人（2006）和Horner等人（2009），并且如本文所述使用， et al。（2015）。我们感谢博士。 Melissa Wells和Diana Cruz-Topete对协议的意见。这项研究由国立环境卫生科学研究所，国立卫生研究院的校内研究计划支持。

参考文献

Horner，TJ，Lai，WS，Stumpo，DJ和Blackshear，PJ（2009）。

Lai，WS，Parker，JS，Grissom，SF，Stumpo，DJ和Blackshear，PJ（2006）。通过在TTP缺陷成纤维细胞中稳定转录物的全面分析鉴定的三四脯氨酸（TTP）的新型mRNA靶标。：9196-9208。

Pfaffl，MW（2001）。一个新的数学模型在实时RT-PCR中的相对定量。 Nucleic Acids Res 29（9）：e45。

Qiu，LQ，Lai，WS，Bradbury，A.，Zeldin，DC和Blackshear，PJ（2015）。三四脯氨酸（TTP）协调调节原发性和继发性细胞对促炎症刺激的反应。 Leukoc Biol 97（4）：723-736。