材料和试剂

盐酸（Sigma-Aldrich，目录号：653799）
氢氧化钠
葡萄糖（HK）测定试剂（Sigma-Aldrich，目录号：G2020）
β-D（+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G5767）
ddH sub 2 O
液氮
2.0 M HCl
2.0 M NaOH

设备

离心机（Eppendorf，Model 5415D）
低温小瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：5000-0012）
2ml具有锁定盖的Eppendorf管（Thermo Fisher Scientific，目录号：02-681-299）
Spectra Max 384分光光度计（Molecular Devices）
余额
石英比色皿
剪刀

程序

肝样品制备
1. 牺牲非禁食动物并分离肝切片。将样品转移到低温小瓶中，在液氮中快速冷冻，并在使用前储存在-80℃ 注意：
  1. 在下午或晚上收集肝脏样本，当动物喂食良好。
  2. 尝试从同一区域收集样品（我通常使用右肝叶）。
  3. 记录研究受试者的生长和营养状况（体重，耗水量等）。
  4. 在一个月内使用冷冻的样品（我从来没有提到在长期储存过程中是否会发生糖原的降解）。
2. 对于每个单个样品，在带有锁定盖的2ml Eppendorf管中制备0.5ml的2.0M HCl。作为测量游离葡萄糖的对照，用2.0M NaOH代替2.0M HCl。用HCl或NaOH制备和标记足够的管子
3. 在沸水中加热管子约3至5分钟。
4. 短暂离心，然后擦拭试管，并在分析天平上测量重量
5. 在干冰上制备冷冻肝脏样品。用热HCl或NaOH将约10mg至20mg样品转移到上述管中。在天平上再次测量重量。
6. 紧紧密封管，将样品在水中煮沸1小时。为了实现完全水解，用剪刀在〜5分钟内切碎肝脏样品，然后每10分钟剧烈摇动管整个过程
7. 将样品在台上冷却至室温（RT），并短暂离心。通过添加ddH _{2重建原始权重。}
8. 因此，用0.5ml的2.0M NaOH或HCl中和水解产物
9. 涡旋样品，然后以最大速度离心（，即〜22,000in×g ）10分钟。
葡萄糖水平测定 - 可以使用葡萄糖（HK）测定试剂测定水解产物的葡萄糖浓度。
1. 用20mL ddH 2 O重建测定试剂，并在两个月内使用该试剂。
2. 对于每个单个样品，在Eppendorf管中制备1ml测定试剂，然后加入10μl水解产物的上清液。同时，使用10μl新制备的0.5mMβ-D（+） - 葡萄糖作为标准品，和10μlddH 2 O作为空白。
3. 在室温下孵育5分钟。
4. 使用石英比色杯在Spectra Max 384分光光度计上测量340nm处的吸光度
肝糖原含量测定为：
Abs（样品）/Abs（标准）x浓度（标准）（即，0.5mM）x体积（标准）（即0.01ml）x总体积（

笔记

请注意，性别，年龄，遗传背景，特别是喂养状况，可能受房屋光 - 黑暗循环影响，可以影响肝脏中的糖原水平。自由进食的动物应该用于这种类型的实验。

食谱

2.0 M HCl
2.0 M NaOH
葡萄糖（HK）测定试剂

致谢

该协议改编自Passonneau和Lauderdale的先前描述的工作（Passonneau和Lauderdale，1974）。 PZ由宾夕法尼亚州立大学Cavener实验室的研究助理支持。这项工作得到了授予DC的NIH R01资助。

参考文献

Passonneau，J.V.and Lauderdale，V.R。（1974）。组织中糖原测量的三种方法的比较。 /em> 60（2）：405-412。
Zhang，P.，McGrath，B.，Li，S.，Frank，A.，Zambito，F.，Reinert，J.，Gannon，M.，Ma，K.，McNaughton，K.and Cavener，DR ）。 PERK真核起始因子2α激酶是骨骼系统发育，出生后生长所必需的，和胰腺的功能和存活力。 Mol Cell Biol 22（11）：3864-3874。