材料和试剂

猎鹰管（50ml）（Sarsdtedt）
无菌移液器（Sarsdtedt）
100 mm细胞培养皿（Sarsdtedt）
铝箔
来自新鲜安乐死的小鼠（C57B16/J）的成年小鼠心脏
NaCl（Carl Roth，目录号：3957.2）
KCl（Carl Roth，目录号：HNO2.3）
（Carl Roth，目录号：4984.1）。
（AppliChem，目录号：A2946）
CaCl 2（AppliChem，目录号：A3652）
（AppliChem，目录号：A1037）。
NaHCO 3（AppliChem，目录号：A1940）
胶原酶II（Worthington，目录号：LS004177）
2.5％胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15090-046）
DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31331-028）
PBS（无CaCl 2，MgCl 2）（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：14190-94）
FBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10270-106）
PenStrep（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15140-122）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：25030-024）
抗坏血酸（AppliChem，目录号：A1052）
PBS（请参阅配方）
Hanks平衡盐溶液（HBSS）（参见配方）
胶原酶II原液（见配方）
消化缓冲液（参见配方）
成纤维细胞培养基（参见配方）

设备

手术刀，镊子和剪刀（Fine Science Tools）
具有磁力搅拌器的高压灭菌的玻璃烧杯（100ml）
无菌细胞培养罩
细胞培养孵化器（Labotect Labor-TechnikG?ttingen）
具有恒温器的磁力搅拌器（IKA -Werke GmbH& CO.KG）
细胞培养离心机（Eppendorf，型号：5417R）
高压灭菌器

程序

从新鲜安乐死的小鼠中取出3只成年老鼠心脏，并将它们放在含有冰冷PBS的培养皿中
将心脏放置在无菌细胞培养罩下，并在无菌条件下进行以下步骤
通过使用镊子将血液泵出心脏。
剁碎在一个培养皿的3心脏在冰。通过使用剪刀将心脏切成10片，使用手术刀将它们切成1毫米的大小。
在带有磁力搅拌器的高压灭菌玻璃烧杯中转移切碎的组织（使用手术刀作为刮刀），并用铝箔覆盖烧杯。
加入25ml消化缓冲液，消化组织在37℃恒定搅拌5分钟。
注意：搅拌速度应该调整，使所有的组织只是流动，不要坐在底部，但不应太强，以破坏细胞。
离开混合物1分钟以使组织坐下，并丢弃含有碎片和血细胞的第一上清液
加入25毫升消化缓冲液，消化组织，在37℃持续搅拌10分钟
离开混合物1分钟使组织坐下，并用25ml移液管（约22ml）收集上清液。不要收集易于浮起的纸巾片。
将上清液放置在含有2ml成纤维细胞培养基的冰上的塑料50ml falcon管中。如果可能的上清液可以在一只猎鹰中组合，但是每个上清液需要2ml成纤维细胞培养基。
重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。
在4℃下以300×g离心细胞5分钟。
将细胞重悬在20ml成纤维细胞培养基中
将细胞悬浮液置于两个100mm细胞培养皿（10ml细胞悬浮液/皿）中，并在37℃下在具有5％CO 2的细胞培养箱中孵育2小时（"电镀"）。
2小时电镀活的和健康的成纤维细胞应该已经粘附到菜。检查细胞汇合在显微镜下（它应该在50％左右）。此时成纤维细胞类似小圆点。
收集并弃去上清液。用2.5ml温热PBS洗涤3次，并补充10ml新鲜成纤维细胞培养基。在37℃和5％CO 2下在细胞培养箱中培养
原代成年小鼠成纤维细胞分裂少于胚胎的，在我们的培养条件下具有36-48小时的倍增时间。通常，在铺板后2-3天，成纤维细胞达到90％汇合。
注意：注意！不要分裂成纤维细胞，直到它们达到80％的最小汇合，因为成纤维细胞生长速率会降低，并且它们会分化。
一旦达到融合，成纤维细胞如下胰蛋白酶化。
用2ml预热的PBS洗涤两次，然后加入2ml温热胰蛋白酶。在37℃下，在细胞培养箱中孵育5分钟。控制成纤维细胞是否从板上分离。如果不延长孵育直到细胞分离。
通过加入7ml预热的成纤维细胞培养基中和胰蛋白酶。
为了实现30％的重铺镀层汇合，1：3分裂成3个新的100mm板。在含有7ml新鲜和温热成纤维细胞培养基（终体积/板10ml）的平板中加入3ml成纤维细胞悬浮液。

代表数据

有关代表性照片和结果，请参阅Zafiriou等人（2014）。

笔记

注意，作为成纤维细胞的初级分离细胞在长时间（超过20天）停止分裂时分化（Bayreuther等人，1988）。此外，使用来自相同通道的细胞导致更好的再现性。因此，我们建议使用通道4成纤维细胞进行所有共培养实验。

食谱

PBS，1 L
将以下物质溶于800ml蒸馏的H 2 O（dH 2 O）中。
8克NaCl
0.2克KCl
1.44g的Na 2 HPO 4
0.24g的KH 2 PO 4 sub/
用HCl调节pH至7.4，加入dH 2 O至1L，通过高压灭菌灭菌
Hanks平衡盐溶液（HBSS）（100ml）

储备溶液1：8.0g NaCl，0.4g KCl在100ml dH 2 O中
储备溶液2：在100ml dH中的0.358g Na 2 HPO 4，0.6g KH 2 PO 4， sub> 2 O
储备溶液3：0.72g CaCl 2在50ml dH 2 O中
储备溶液4：1.23g MgSO 4。在50ml dH 2 O中的7H 2 O溶液
储备溶液5：在10ml dH 2 O中的0.35g NaHCO 3
HBSS缓冲液：10ml溶液1,1ml溶液2,1ml溶液3,86ml dH 2 O，1ml溶液4,1ml溶液5（0.137M NaCl，5.4mM KCl，0.25 1mM Na 2 HPO 4，0.44KH 2 PO 4，1.3mM CaCl 2，3mM CaCl 2 ，1mM MgSO 4，4.2mM NaHCO 3）

胶原酶II原液（1ml）称量适当量的胶原酶（根据批次不同），以获得10,000U，并溶解于1ml无菌水中
消化缓冲液（100ml）
95 ml HBSS缓冲液
1ml胶原酶II（终浓度100U/ml） 4ml 2.5％胰蛋白酶（最终浓度0.1％）过滤灭菌
为了最佳酶活性总是准备新鲜。
成纤维细胞培养基
DMEM/F12
10％FBS
100 U/ml PenStrep
1x L-谷氨酰胺
100μM抗坏血酸
过滤灭菌整个培养基，并保持在4℃

致谢

该方案通过Lafontant等人（2006）和Ohkubo等人（1997）描述的方法进行修改。
HBSS食谱是从互联网网站labrat.com检索的（链接： http ：//www.thelabrat.com/protocols/Hanks.shtml ）。
这项工作得到了德国心脏病研究中心（ZE900/1-1; ZI708/7-1,8-1,10-1; SFB1002; exFLIII）和德国心血管研究中心（DZHK）的支持。

参考文献

Bayreuther，K.，Rodemann，HP，Hommel，R.，Dittmann，K.，Albiez，M.and Francz，PI（1988）。制瘤素M差异调节小鼠心脏成纤维细胞中的CXC趋化因子。 Am J Physiol Cell Physiol 291（1）：C18- 26.

Ohkubo，N.，Matsubara，H.，Nozawa，Y.，Mori，Y.，Murasawa，S.，Kijima，K.，Maruyama，K.，Masaki，H.，Tsutumi，Y.，Shibazaki， Iwasaka，T。和Inada，M。（1997）。血管紧张素2型受体由来自衰竭的肌病仓鼠心脏的心脏成纤维细胞再表达，并抑制细胞生长和纤维胶原蛋白代谢。循环 96（11）：3954-3962。

Zafiriou，MP，Noack，C.，Unsold，B.，Didie，M.，Pavlova，E.，Fischer，HJ，Reichardt，HM，Bergmann，MW，El-Armouche，A.，Zimmermann，WHand Zelarayan，LC （2014）。红细胞生成素反应性心肌形成细胞有助于心脏修复post myocardial infarction。 Stem Cells 32（9）：2480-2491。