材料和试剂

15ml聚丙烯锥形管（Corning，目录号：430790）
50ml聚丙烯锥形管（Corning，目录号：430828）
LS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
用于供体（男性）的6-8周龄C57BL/6J WT小鼠
6-8周龄免疫缺陷型RAG1 -/- 小鼠（雄性）（Jackson Laboratory，股票号：002216）
10cm培养皿（Corning，目录号：430167）
10ml注射器（BD Biosciences，目录号：301604）
27号针（BD Biosciences，目录号：305109）
40μm尼龙细胞过滤器（Corning，Falcon ，目录号：352340）
70μm细胞过滤器（Corning，Falcon ，目录号：352350）
聚苯乙烯圆底流管（Corning，Falcon ，目录号：352054）
FBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10100-147）
RPMI培养基1640（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11875-093）
ACK裂解缓冲液用于红细胞裂解（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：A10492-1）
小鼠CD4阴性分离试剂盒（Miltenyi Biotec，目录号：130-095-248）
荧光标记抗体：

抗CD25-PE（BioLegend，目录号：102012）
抗CD4-PE-Cy7（BD Biosciences，目录号：563933）
抗CD44-APC（BD Biosciences，目录号：559250）
抗CD62L-FITC（BD Biosciences，目录号：553150）

37％甲醛（福尔马林）溶液（Avantor Performance Materials，J.T.Baker ，目录号：2016）
FACS缓冲液（见配方）

设备

普通玻璃显微镜载玻片（Omano，目录号：OMSK-50PL）
血细胞计数器
光学显微镜
顶部装入余额
离心机
流式细胞术（BD Biosciences，型号：ARIA III）

程序

使用磁珠富集CD4 + T细胞
1. 安乐死供体WT小鼠。
2. 从鼠收获脾脏。
3. 将解剖的器官在10厘米培养皿与10毫升PBS + 2％FBS。使用两片无菌磨砂玻璃（保持在-20°C提前1小时）载玻片轻轻研磨组织。有关详细的磨削程序，请参阅 http：//www.bio-protocol。 org/e834 。
4. 将70μm细胞过滤器置于50ml管的顶部，并将液体从盘转移至过滤器
5. 在4℃，300×g下旋转脾悬液5分钟（注意：这应该是所有步骤的离心条件。）。通过抽吸弃去上清液，小心不要打扰药丸
6. 加入4ml ACK裂解缓冲液，并在室温下孵育3分钟。再加入10ml PBS + 2％FBS
7. 将40μm细胞过滤器置于50ml管的顶部，并将流体从50ml管转移至过滤器。旋转5分钟，倒掉上清液。
8. 用10ml PBS + 2％FBS洗涤细胞2次。用PBS + 2％FBS缓冲液重悬细胞。取等分试样计数细胞。加入10微升的细胞悬浮液到90微升的台盼蓝溶液（1:10稀释），并使用血细胞计数器计数细胞。
9. 通过使用miltenyi CD4 ⁺ T细胞分离试剂盒富集CD4 ⁺ T细胞。
10. 按照阴性选择方案，通过在4℃下以300×g离心10分钟沉淀细胞。
11. 通过抽吸弃去大部分上清液;通过小心吸取上下数次，将细胞沉淀重悬在1ml PBS + 2％FBS缓冲液中。取等分试样计数细胞。加入10微升的细胞悬浮液到90微升的台盼蓝溶液（1:10稀释），并使用血细胞计数器计数细胞。
细胞表面抗原染色用于细胞分选
1. 我们将适当数量的细胞转移到FACS管中，并在300-400×g下旋转5分钟。
2. 准备含有用含2％FBS的1×PBS稀释至最佳浓度（1:100）的抗CD4-PE-Cy7，抗CD25-PE，抗CD44-APC，抗CD62L-FITC抗体的抗体混合物。对于每一百万个细胞，我们通常添加100μl1×PBS与2％FBS缓冲液与稀释的抗体孵育。根据比率和要染色的细胞，制备抗体/PBS主混合物
3. 重悬细胞在含有2％FBS的1×PBS中，以获得25-50×10 6个细胞/ml的浓度。细胞的浓度取决于待使用的特定细胞分选仪。将上述混合物加入细胞沉淀中。涡旋混合好。在4℃下染色15分钟。
4. 通过用1x PBS + 2％FBS填充管来洗涤细胞两次。在4℃下以300×g离心5分钟。倒出液体。
5. 如果可见碎屑或团块，在细胞分选之前需要使细胞通过40μm细胞过滤器
6. 保护细胞免受光照，并在分选前置于冰上
7. 将天然T细胞（CD4阳性+ CD25阳性CD44阳性CD62L阳性）和Treg群体（CD4 ⁺ CD25 ^hi）注射到含有2％FBS的RPMI培养基1640中。
用流动纯化的幼稚T细胞和Treg细胞注射RAG1 /- 小鼠
1. 分选后，用冷的1x PBS填充含有分选的细胞的收集管，以如上所述通过离心收集壁中的细胞和沉淀。始终保持细胞在冰上，以避免在每一步中聚集
2. 用冷的1x PBS洗涤细胞2次。此步骤旨在耗尽跟踪FBS。非常轻轻地重悬细胞，并准备与PBS的单细胞悬浮液，并在注射前将细胞置于冰上。取等分试样计数细胞。添加10微升的细胞悬液到90微升的台盼蓝溶液（1:10稀释），并取10微升稀释的细胞悬液，使用血细胞计数器计数细胞。
3. 计数后，用冷的1x PBS稀释细胞，并调节至2×10 6/ml的最终细胞浓度。在注射之前将注射管保持在冰上。
4. 混合不同组的细胞。对于每只小鼠，将4×10 5个天然T细胞单独（200μl）或4×10 5个初始T（200μl）连同2×10 5个5 Treg细胞（100μl）混合
5. 称重受体小鼠使用顶部负载平衡和记录重量。在注射小鼠之前，轻轻地倒转管以混合细胞。
6. 限制鼠标使用尾部访问鼠标限制器。有关详细限制器图片，请参阅： http：//www .stoeltingco.com/neuroscience/misc/restrainers.html 。稍微旋转尾部以显现静脉。非常缓慢地将细胞吸入1毫升注射器与27号针连接。将针头轻轻插入静脉，注射所有细胞。
监测疾病进展和结肠炎评估
通过使用顶部负载平衡每周两次称重每只小鼠来监测疾病进展。小鼠在接下来的5-7周内通常缓慢但逐渐减轻体重，伴随出现松散的粪便和腹泻以及"蜷缩"的外观。
注意：一些小鼠不会出现明显的大便和腹泻。然而，这些小鼠仍然可能发展显着的肠炎症，这将在H& E染色时可见。
1. 当小鼠失去其原始体重的约15-20％或在注射后约40天时，应对动物实施安乐死并评估结肠炎的证据。
2. 从肛门小心切除整个结肠，切除它的肠系膜从盲肠下面到肛门开口上方。小心不要伸展结肠。
3. 将结肠放在塑料板上，测量并记录其长度。然后通过注射PBS清洁粪便。称重结肠组织
4. 可以记录结肠长度和重量以计算长度重量比，其已经显示与盲的组织病理学评分良好相关。
5. 对于组织学加工和盲目的组织病理学评分，获得从结肠的近端和远端部分的小（0.5cm）片。然后将这些组织片置于10％PBS-福尔马林中，并在石蜡包埋之前在室温下固定至少24小时。
6. 将固定组织嵌入石蜡块。石蜡包埋样品的截面产生4μm切片。在微观载玻片上安装三个切片，用苏木精和曙红染色切片
7. 使用以下评分标准进行盲法组织病理学分析：
  1. 固有层炎症程度（0-3分）
  2. 杯状细胞丢失（得分0-2）
  3. 异常隐窝（得分0-3）
  4. 存在隐窝脓肿（得分0-1）
  5. 粘膜侵蚀和溃疡（0-3分）
  6. 黏膜下粘膜扩散至透壁受累（分值0-3）
  7. 以40×放大倍数计数的嗜中性粒细胞数（分数0-4）
  通过组合七个参数中的每一个的得分来计算总组织病理学得分，最大得分为17.

代表数据

图1.初始T细胞标记物的示意图。将脾细胞重悬并用含有抗CD4-PE-Cy7，抗CD25-PE，抗CD44-APC，抗CD44- CD62L-FITC抗体在4℃孵育15分钟。如上所述门控天然T细胞（CD4 + CD25 + CD44 + CD62L ^hi）。

图2：如何研究结肠炎的T细胞转移模型的示意图。每个Rag1 受体小鼠用4×10 5个/sup /分离自野生型小鼠的CD4 + CD25L初级T细胞和CD4 + CD25 +初级CD44L + CD4 + CD25L初级T细胞，用从WT分离的2×10 5个CD4 + Treg细胞（b）转移。（a）中的小鼠的体重减轻是从注射后第40天开始每四天监测一次。每组6只小鼠。（c）来自未处理的WT小鼠（对照），用WT天然T细胞（天然），Rag1 -/- 小鼠转移的Rag1 -/- 小鼠的结肠切片的代表性H&与初始T细胞和WT Treg细胞（初始+ WT Treg（原始放大倍数，20x））共转染的小鼠。

笔记

转移导致没有结肠炎发展。可能的原因：

转移低天然T细胞数。
细胞活力是另一个关键因素。确保细胞总是保持在冰上。重要的是在分选完成后评估细胞活力，并且只有> 90％的生存力是可接受的转移。

重要的是要记住，这种模型取决于许多额外的因素，除了幼稚T细胞，充足的幼稚T细胞和良好的动物程序的可行性。这些包括动物房屋的清洁和受体小鼠中完整的肠道菌群。

食谱

FACS缓冲区
2％FBS的PBS溶液，保持冷以进行染色

致谢

这个协议是从我们以前的工作Pan 等人修改（2015）。这项工作得到了973项目（2014CB541902，2014CB541901），中国国家自然科学基金（81230072，81025016，31370880），中国科学院重点研究计划（KSZD-EW-Z-003-3），以及中国卫生部（201202008）和上海科学技术委员会计划（12431900703,12JC1406000,12ZR1435900）。

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