材料和试剂

Talon HiTrap柱，1ml（GE Healthcare，目录号：28-9537-66）
24孔结晶板，VDX润滑板（Hampton Research Corporation，目录号：HR3-170）
盖玻片，22mm，硅化（Hampton Research Corporation，目录号：HR3-233）
尼龙亲水膜过滤器，0.2μm（Merck Millipore Corporation，目录号：GNWP04700）
Ultrafree离心过滤器，0.1μm（Merck Millipore Corporation，目录号：UFC30VV00）
LB（Luria Bertani）琼脂平板上
大肠杆菌（大肠杆菌）BL21 Rosetta（DE3）（Merck Millipore Corporation，Novagen，目录号：70954）
pGEX-6P1载体（GE Healthcare，目录号：28-9546-48）
pET-24b载体（Merck Millipore Corporation，目录号：69750-3），修饰成包括编码His 6 -SUMO标签的序列，随后是PreScission切割位点
氨苄青霉素（Fisher Scientific，目录号：BP1760-25）
卡那霉素（Fisher Scientific，Durable，目录号：BP906-5）
氯霉素（Fisher Scientific，Bioreagents，目录号：BP904-100）
胰蛋白胨（Fisher Scientific，目录号：BP1421-2）
酵母提取物（Fisher Scientific，目录号：BP1422-2）
甘油（P212121，目录号：RP-G22020-0.5）
（Fisher Scientific，目录号：P386-500）< br />
（Fisher Scientific，目录号：LC200901）
葡萄糖（American Bio，目录号：AB00715）
乳糖（Fisher Scientific，Durable，目录号：L5-500）
MgSO 4·7H 2 O（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：63140）
无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物片剂（Sigma-Aldrich，cOmplete ^TM，目录号：5056489001）
来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25-1g）
HEPES（Fisher Scientific，Durable，目录号：BP310500）
氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，Durable，目录号：S271-10）
TCEP HCl（P212121，目录号：SV-TCEP-25g）
咪唑（Thermo Fisher Scientific，ACROS Organics，目录号：301870010）
Ni Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare，目录号：17-5318-02）
谷胱甘肽琼脂糖4B（GE Healthcare，目录号：17-0756-05）
PreScission蛋白酶（内部生产;更多信息参见参考文献3）
12％Mini Protean TGX预制凝胶（Bio-Rad Laboratories，目录号：456-1046）
Coomassie Brilliant Blue R-250（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0400）
乙酸（Fisher Scientific，Durable，目录号：A491-212）
乙醇，190标准（Fisher Scientific，Durable，目录号：04-355-226）
盐酸胍（Sigma-Aldrich，目录号：50950）
柠檬酸三钠脱水物（Alfa Aesar，目录号：36439-A3）
NiCl 2六水合物（Alfa Aesar，目录号：43185）
聚乙二醇8000（Sigma-Aldrich，目录号：89510）
NaSCN（VWR International，目录号：10118-142）
聚乙二醇3350（Sigma-Aldrich，目录号：P3640）
注意：产品P3640已停产。
中赤藓糖醇（VWR International，目录号：CAAAA15813-22）
TB（极好的肉汤）培养基（见配方）
裂解缓冲液（见配方）
凝胶过滤缓冲液（见配方）

设备

标准实验室设备
分光光度计装置（Thermo Fisher Scientific，NanoDrop ，型号：1000）或类似的UV/VIS分光光度计
注意：此产品已由制造商停产。
微流化器细胞破碎仪（Microfluidics，型号：110S）或类似的细胞裂解设备
注意：此产品已由制造商停产。
泵（Bio-Rad Laboratories，型号：EP-1）注意：此产品已由制造商停产。
色谱系统（Bio-Rad Laboratories，DuoFlow ^TM，型号：中压）或类似的色谱系统
Superdex 75 10/300（GE Healthcare，目录号：17-5174-01）
立体显微镜（ZEISS，型号：SteREO Discovery V8）或相当的显微镜
带有Ultracel-50膜的Amicon Ultra-15离心过滤器单元（Merck Millipore Corporation，目录号：UFC905096）
超声波浴（Fisher Scientific，型号：FS60）或类似的超声处理装置
注意：此产品已由制造商停用。

程序

在His6-SUMO-3C-pET24b和HSV-1UL34（51-306）或PRV UL34（18-271）中编码HSV-1UL31（15-185）或PRV UL31（1-176）的共转化质粒，，在pGEX-6P1中，转化为E。使用热休克转化的大肠杆菌 Rosetta细胞。在含有100mg/L氨苄青霉素，50mg/L卡那霉素和34mg/L氯霉素的LB-琼脂平板上平板。
挑取单个菌落以接种含有1％葡萄糖，2mM MgSO 4，34mg/L氯霉素，100mg/L氨苄青霉素和100mg/L卡那霉素的50ml TB培养基的发酵剂培养物。在37°C，200 rpm下，在振荡器中孵育培养物16小时
用10ml起始培养物接种含有0.2％乳糖，2mM MgSO 4，100mg/L氨苄青霉素和100mg/L卡那霉素的3L TB，并在37℃，200rpm， 4小时。将温度降低至25℃，并再培养16小时。通常达到5-6的最终OD <600> 。
通过在4℃下以5,000xg离心30分钟收获细胞
过滤和脱气净化中使用的所有缓冲液。
在整个纯化过程中，通过SDS-PAGE分析和考马斯染色确认纯化蛋白质的存在和质量（图1）。通过测量OD细胞的280消光系数：37,360μMsup-1（HSV-1 NEC）和34,840μM荧光素酶来确定蛋白质浓度，使用分光光度计，测量p -1 cm ^-1（PRV NEC）。
在裂解缓冲液中洗涤细胞沉淀，并在5000ml锥形管中在5,000xg在4℃下离心5分钟。弃去上清液，立即处理颗粒或在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃
将细胞沉淀悬浮在补充有完全蛋白酶抑制剂混合物（一片/25ml裂解物）和DNase I（一个铲尖/50ml裂解物）的裂解缓冲液中。
在微流化器（3次运行，80psi）中裂解细胞。可以使用类似的细胞破碎剂。
通过在4℃下以20,000×g离心30分钟来清除细胞裂解物。所有后续步骤均应在4°C或冰上进行
将上清液施加到Ni-NTA琼脂糖柱（8ml）上，用裂解缓冲液平衡，流速为2ml/min，用含有20-40mM咪唑的裂解缓冲液洗涤。用含有250mM咪唑的裂解缓冲液洗脱结合的蛋白质。
使洗脱的蛋白通过GSH琼脂糖柱（8ml），用裂解缓冲液平衡，以除去过量的His 6 -SUMO-UL31。在用裂解缓冲液洗涤后，使用1:30摩尔比的PreScission蛋白酶，在一个柱体积裂解缓冲液中，在流速下循环，在GSH柱上切割His 6 -SUMO和GST标签16小时为0.3ml/min
将裂解缓冲液应用于GSH琼脂糖柱，并收集含有未标记的NEC和His 6 -SUMO的流通级分。将该样品应用于2个串联偶联的1ml Talon HiTrap柱，以从NEC中分离His 6 6 -SUMO。收集含有未标记NEC的流通级分，并使用MWCO为50kDa的浓缩器浓缩。
在不同蛋白质制备之间，用一柱体积6M盐酸胍和0.2M乙酸洗涤Ni-NTA和GSH柱。然后用10个柱体积的dH 2 O洗涤
为了获得单分散NEC，作为最终纯化步骤，将来自步骤13的浓缩样品应用于用凝胶过滤缓冲液平衡的Superdex 75 10/300柱。
从单分散峰收集含NEC的级分，并浓缩至?10mg/ml。等分蛋白样品并在液氮中快速冷冻，用于随后在-80℃下储存。典型产率为每L TB培养物10mg单分散NEC
在结晶之前，将蛋白质稀释至5mg/ml，并通过0.1μm膜过滤以除去聚集体
通过在悬滴中通过在10％PEG 8000,0.1M柠檬酸钠，pH 5.6,5mM NiCl 2中在22℃下的0.5μl蛋白质和0.5μl储存溶液中的蒸汽扩散来生长HSV-1 NEC晶体。 HSV-1 NEC晶体类似于六角形板，在2天后出现，并在1周后达到其最终尺寸（图2A）。
在含有25％甘油作为冷冻保护剂的储存溶液中短暂地浸泡HSV-1 NEC晶体，并在液氮中快速冷冻。
生长PRV NEC晶体通过蒸汽扩散悬滴在0.5％蛋白质和0.5升储存溶液在18％PEG 3350,0.3 M NaSCN，0.3 M NaCl在22℃。一天后出现PRV NEC的四方晶体，2天后达到最终尺寸（图2B）。
在含有15％内消旋赤藓醇作为冷冻保护剂的储液中短暂浸泡PRV NEC晶体，并在液氮中快速冷冻。

代表数据

图1.纯HSV-1和PRV NEC 的12％SDS-PAGE分析

图2. HSV-1 NEC（A）和PRV NEC（B）的晶体。晶体在22℃下悬滴生长。用于生长HVS-1 NEC晶体的储存溶液含有10％PEG 8000,0.1M柠檬酸钠，pH 5.6,5mM NiCl 2以及用于PRV NEC晶体的18％PEG 3350,0.3M NaSCN， 0.3 M NaCl。

笔记

HSV-1 NEC的结晶取决于涉及Cys278 sub-UL31的二硫键的形成。因此，在纯化过程中可以使用不超过0.5mM的TCEP。两种蛋白质复合物应该在40小时内被纯化和冷冻以防止降解和聚集。

食谱

TB培养基（每升），高压灭菌或过滤灭菌
12克胰蛋白胨
24g酵母提取物
4ml甘油 0.231g KH 2 PO 4 sub/
1.254g K 2 HPO 4
裂解缓冲液
50mM HEPES，pH7.0 500 mM NaCl
10％甘油 0.5 mM TCEP
凝胶过滤缓冲液
20mM HEPES，pH7.0 100 mM NaCl
0.5 mM TCEP

致谢

这项工作由NIH赠款1R21AI097573和1R01GM111795（E.E.H.），Burroughs Wellcome基金（E.E.H）和来自Deutsche Forschungsgemeinschaft GZ：BI 1658/1-1（J.M.B.）的博士后研究金资助。该方案的一部分先前在Bigalke等人，2014和Bigalke& Heldwein，2015。

参考文献

Bigalke，JM，Heuser，T.，Nicastro，D。和Heldwein，EE（2014）。由HSV-1核出口复合物引起的膜变形和分裂。 Nat Commun 5：4131.

Bigalke，JM和Heldwein，EE（2015）。结构通过疱疹病毒的核出口复合物的膜出芽的基础.EMEM EMBO杂志34（23）：2921-2936。

Pitts，JD，Klabis，J.，Richards，AL，Smith，GA and Heldwein，EE（2014）。疱疹病毒内膜蛋白UL37的晶体结构支持其在控制病毒性运输中的重要作用。：5462-5473。