材料和试剂

材料
1. 一次性无RNase移液器吸头（1-200μl和100-1,000μl通用吸头）
2. 无RNase的微量离心管（1.5ml和2.0ml通用试管）
3. 15 ml锥形管
4. Amicon Ultra-15离心过滤器单元，10KDa（Merck Millipore Corporation，目录号：UFC901024）
5. PVDF膜（Carl Roth，Roti-氟，目录号：2803.1）
6. 聚丙烯离心管，14×95mm（Beckman，目录号：331374）
植物材料
1. 玉米幼苗在26-28℃下在土壤中生长7-10天，周期为16小时光/8小时黑暗
抗体
1. 抗ZmpTAC12（定制抗体）（Biogenes）
2. 抗ZmRpoA（定制抗体）（Biogenes）
3. 山羊抗兔IgG HRP-连接（Sigma-Aldrich，目录号：A6154）
试剂
1. 液氮
2. 丙烯酰胺，Gel 40（29：1）（Carl Roth，Rotiphorese ，目录号：A515.1）
3. 将过硫酸铵（APS）（NH 4）2 SubS 2 O 8（Sigma-Aldrich，目录号：248614-500G-D）
4. 双 - （2-羟乙基） - 亚氨基 - 三 - （羟甲基） - 甲烷，Bis-Tris（Carl Roth，目录号：9140.3）
5. β-巯基乙醇（Carl Roth，目录号：4227.1）
6. Bradford，Roti Nanoquant（Carl Roth，目录号：K880.1）
7. 考马斯亮蓝G250（Sigma-Aldrich，目录号：B0770-5G）
8. 1,4-二硫苏糖醇，DTT（Carl Roth，目录号：6908.1）
9. ε-氨基己酸（Carl Roth，目录号：3113.2）
10. 甘油（Carl Roth，目录号：6962.3）
11. 甘氨酸（Carl Roth，目录号：3187.4）
12. HEPES（Carl Roth，目录号：9105.3）
13. 醋酸镁四水合物，Mg（CH 3 COO）2·4H 2 O（Carl Roth，目录号：0275.2）
14. 氯化镁，MgCl 2（Carl Roth，目录号：KK36.3）
15. 甲醇（Carl Roth，目录号：P717.1）
16. 正十二烷基β-D-麦芽糖苷，β-DM（Sigma-Aldrich，目录号：D4641-1G）
17. N，N，N'，N' - 四甲基乙二胺（TEMED）（Carl Roth，目录号：2367.1）
18. N-Tris-（羟甲基） - 甲基 - 甘氨酸，Tricin（Carl Roth，目录号：6977.3）
19. BlueEasy Prestained Protein Marker（Nippon Genetics，目录号：MWP06）
20. 乙酸钾K（CH 3 COO）（Carl Roth，目录号：T874.1）
21. 氢氧化钾（Carl Roth，目录号：7986.1）
22. 蛋白酶抑制剂混合物（cOmplete）
  注意：目前，它是"Sigma-Aldrich，cOmplete ^TM，目录号： 000000011836153001"。
23. 三 - （羟甲基） - 氨基甲烷，TRIS（Carl Roth，目录号：4855.3）
24. Triton X-100（Carl Roth，目录号：3051.2）
25. Tween-20（Carl Roth，目录号：9127.1）
26. 氯化钠，NaCl（Carl Roth，目录号：9265.2）
27. 十二烷基硫酸钠，SDS（Carl Roth，目录号：4360.2）
28. 氟化钠，NaF（Carl Roth，目录号：4503.2）
29. D-蔗糖[D（+） - 蔗糖] Carl Roth，目录号：4621.2）
缓冲区
1. BN-Lysis缓冲液（见配方）
2. 3x BN-Gel缓冲液（见配方）
3. 4.5％分离凝胶（见配方）
4. 14％分离凝胶（见配方）
5. 4％堆叠凝胶（见配方）
6. 阴极缓冲液蓝色（见配方）
7. 阴极缓冲液（见配方）
8. 阳极缓冲液（见配方）
9. 2x BisTris ACA（ACA，氨基己酸）（参见配方）
10. 示例缓冲区（参见配方）
11. 2％正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷（β-DM）溶液（参见配方）
12. BN加载缓冲区（参见配方）
13. 传输缓冲区（请参阅配方）
14. 1x TBST缓冲区（参见配方）
15. 低蔗糖溶液（见配方）
16. 高蔗糖溶液（见配方）
17. 稀释溶液（参见配方）

设备

砂浆和杵
超声波仪（BANDELIN electronic GmbH& Co.，型号：Sonopuls HD 2200）
微量离心机（Beckman，型号：Avanti JXN-30）
超速离心机（Sorvall Discovery 90SE）
注意：此产品已由制造商停产。
SW40转子（Beckman）
梯度混合器（BIO-RAD，型号：385）
注意：此产品已由制造商停产。
生物光度计（Eppendorf）
电泳装置（Hoefer，型号：SE600）
Semi-Dry-Blotter（VWR International，PEQLAB Biotechnologie GmbH）

程序

蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）分析
1. 收集植物组织（一秒一叶的基底一半）到1.5毫升微量离心管，并迅速在液氮中冷冻。冷冻的组织可以在-80℃下储存1-2个月。
  注意：由于PEP亚基的表达在年轻时比成熟叶绿体高，因此在他的研究中使用来自幼叶部分（第二叶的基底一半）的蛋白质。
2. 在预冷的研钵中用杵将组织研磨成在液氮中的细粉末。
3. 让所有的液氮蒸发，然后立即加入200-400μl冰冷的BN-裂解缓冲液直接在研钵中的组织。在添加BN-Lysis缓冲液之前，不要让组织解冻。
4. 如果裂解缓冲液冻结，请等待其解冻，然后再进行下一步骤
5. 将样品保持在冰上，并用杵的10-20次冲击匀浆。
6. 将样品转移到1.5毫升微量离心管，并确定蛋白质浓度注意：浓度应至少为4μg/μl。
7. 分成50-100μl等分试样，在液氮中快速冷冻，储存于-80℃备用
8. 使用梯度混合器从14ml的两种分离溶液（4％和14％丙烯酰胺）中的每一种制备梯度凝胶（凝胶尺寸：18×16×0.15cm）。在凝固之前用堆叠溶液覆盖凝胶。在室温下聚合，然后将凝胶冷却至4℃。
9. 为了准备BN-PAGE，让样品在冰上解冻，然后将10-25μl样品（50-100μg）与25μl样品缓冲液，17μl2％β-DM溶液和4.5μlBN-加载缓冲液。
  注意：使用Bradford测定法测定蛋白质浓度。
10. 在冰上孵育样品10分钟。
11. 在17,500×g和4℃下离心样品10分钟。
12. 将上清液置于孔中，并在4℃下（或在染料前沿迁移约三分之一后）在50V恒定电压下运行凝胶过夜（16-18小时）。
13. 将蓝色阴极缓冲液更换为无染料的阴极缓冲液。
14. 在10mA恒定电流（?600V）下继续电泳，直到染料耗尽（4-5小时）
15. 从玻璃板上取下凝胶，并在预冷（10℃）转移缓冲液中浸泡约1分钟。 30分钟。
16. 使用半干印迹装置（在室温下在0.8-3mA/cm 2下3小时）将蛋白转移到PVDF膜上。
17. 脱去膜在100％甲醇1-3分钟，立即用水冲洗
18. 在4℃下在1×TBST缓冲液中用5％酪蛋白阻断膜过夜
19. 用水简单冲洗膜，然后根据标准方案进行免疫印迹（Sambrook和Russell，2001）。
蔗糖梯度沉降分析。上述样品制备方案可以使用以下修改：
1. 收获组织从2-3苗（第二整叶）。
2. 使用1.5 ml缓冲液进行裂解（步骤A3）。
3. 在将冰转移样品均匀化（步骤A5）到15ml锥形管中之后
4. 超声波样品（尖端宽度2-3毫米）三个周期为10秒，20％功率输出。让样品置于冰上超声1-2分钟（注1）。
5. 将裂解物转移到2.0ml微量离心管中并在4℃下以20,000×g离心30分钟以除去不溶性物质。取每个级分的等分试样并通过免疫印迹分析检测单个PEP亚基（注1）
6. 将上清液转移到新鲜的15ml管中并测定蛋白质浓度注意：浓度应至少为3μg/μl。
7. 将冷冻样品（上清液）置于液氮中，并储存在-80℃备用。
8. 在冰上解冻样品> 30分钟并加入1.5ml稀释液。稀释溶液用于在蔗糖梯度离心之前稀释样品中的甘油浓度
9. 如有必要，使用截止离心过滤装置将样品浓缩至1.0ml
10. 准备12毫升连续梯度的10％至30％蔗糖（从每个6毫升）在14毫升多聚集离心管与梯度混合器（蔗糖梯度制备朱，2012）。
11. 在SW-40转子（4℃）中缓慢加载1.0ml样品（约5mg）至梯度顶部并在146,000×g离心管中离心15小时。
12. 从梯度顶部小心收集500μl级分。
13. 使用等体积（30-50微升）每秒的馏分进行SDS-PAGE和随后的免疫印迹分析与特异于PEP亚单位的抗体。
  
  图1.实验程序流程图

代表数据

图2.通过BN-PAGE分离蛋白质复合物并通过用针对亚基RpoA和pTAC12的抗体进行免疫印迹分析PEP复合体装配物。从第二个基底部分获得约50μg的总叶蛋白叶每个泳道加载。 RpoA，RNA聚合酶α亚基; pTAC12，plastid Transcriptively Active Chromosome 12（注释2）。

图3.蔗糖梯度沉降。来自第二叶的基底半部的总叶蛋白溶解于具有超声处理的BN-裂解缓冲液中，并将可溶性级分进行蔗糖梯度离心以分析PEP-复合体装配（Pfalz 等。，2014）。收集级分并用针对pTAC12，RpoA和Rubisco（RbcL）的抗体进行免疫印迹。用条表示含有Rubisco，PEP（质体编码的RNA聚合酶）和TAC（转录活性染色体）（注2）的各个级分。

笔记

DNA结合的PEP部分（TAC）与类囊体膜紧密相关。它可以通过温和的超声处理释放。为了验证通过超声处理从膜中有效释放PEP，取各级分的等分试样，并通过免疫印迹分析检测单个PEP亚基。
TAC复合物在常规BN-凝胶上不进入分离凝胶，因此不能进行免疫检测。通过BN-PAGE检测的蛋白质代表可溶性PEP复合物。如果复合物被部分组装，则预期将看到朝小尺寸级分的转变。在蛋白质没有正确装配成完整的PEP复合物的情况下，适当的条带将消失（PEP：?1,000kDa）。

食谱

注意：除非另有说明，否则所有缓冲液都应在4°C保存。

BN-裂解缓冲液
100mM Tris-HCl（pH7.3） 10mM MgCl 2/
25％（v/v）甘油 1％（v/v）Triton X-100 5mMβ-巯基乙醇 1x蛋白酶抑制剂混合物
3x BN-Gel缓冲液
150mM Bis-Tris（pH7.0） 1.5 Mε-氨基己酸
4.5％分离凝胶（新鲜制备）
1.80ml丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1） 5.40 ml 3x BN-Gel Buffer
1.80ml 75％甘油
7.13ml dH 2 O·dm / 35微升10％APS
35微升TEMED
14％分离凝胶（新鲜制备）
5.60ml丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）
5.40 ml 3x BN-Gel Buffer
4.6ml 75％甘油 330μldH 2 O
35微升10％APS
35微升TEMED
4％堆叠胶（新鲜制备）
2.1ml丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）
7.00 ml 3x BN-Gel Buffer
75％甘油 11.79ml dH 2 O·dm / 50μl10％APS
60μlTEMED
阴极缓冲蓝
0.5 M tricine
150mM Bis-Tris（pH7.0） 0.02％考马斯蓝G250
阴极缓冲区
0.5 M tricine
150mM Bis-Tris（pH7.0）
阳极缓冲区
0.5 M Bis-Tris（pH 7.0）
2x BisTris ACA（可储存于-20°C）
200mM Bis-Tris（pH7.0） 1 Mε-氨基己酸
样品缓冲液（可储存于-20°C）
125μl100mM Bis-Tris（pH 7.0）
250μl40％甘油 20μl25x蛋白酶抑制剂混合物
5μl1M NaF
100微升dH 2 O 2/d
2％正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷（β-DM）溶液（可储存于-20℃） 125μl100mM Bis-Tris（pH 7.0）
500μl40％甘油
200μl10％β-DM（在dH 2 O中）
50μl25x蛋白酶抑制剂混合物
125微升dH 2 O
BN-加载缓冲液（可储存于-20°C）
50mg考马斯蓝G250
500μl2x BisTris ACA
400μl75％蔗糖
50微升dH 2 O
传输缓冲区
0.5％SDS
25mM Tris-HCl（pH7.6） 192 mM甘氨酸 10％甲醇
1x TBST
25mM Tris-HCl（pH7.5） 125 mM NaCl 0.10％Tween-20
低蔗糖溶液（应每次新鲜制备，并在使用前储存于4°C） 10％（w/v）蔗糖 30mM HEPES-KOH（pH8.0） 100 mM KOAc
10mM Mg（OAc）2
5 mM二硫苏糖醇
高蔗糖溶液（每次应新鲜，使用前储存于4°C） 30％（w/v）蔗糖 30mM HEPES-KOH（pH8.0） 100 mM KOAc
10mM Mg（OAc）2
5mM二硫苏糖醇
稀释溶液（可储存于-20°C）
30mM HEPES-KOH（pH8.0） 200mM KOAc
20mM Mg（OAc）2
2mM二硫苏糖醇 1x蛋白酶抑制剂混合物

致谢

这项工作得到了DFG（PF667-4）的支持。这项工作改编自以前发表的工作（Pfalz等人，2015年）。基本上如Sch?gger和von Jagow所述进行BN-PAGE。

参考文献

Liere，K.，Weihe，A.和Borner，T。（2011）。植物线粒体和叶绿体的转录机制：组成，功能和调节。植物生理 168（12）：1345-1360。

Pfalz，J。和Pfannschmidt，T。（2013）。 Essential nucleoid proteins in early chloroplast development。 Trends Plant Sci 。 18（4）：186-194

Pfalz，J.，Holtzegel，U.，Barkan，A.，Weisheit，W.，Mittag，M.和Pfannschmidt，T。（2015）。 ZmpTAC12结合单链核酸，并且对于质体编码的聚合酶复合物在玉米中的积累是必需的。 New Phytol 206（3）：1024-1037。

Sambrook，J。和Russell，D.W。（2001）。分子克隆：实验室手册。第3版。冷泉港。

Schagger，H。和von Jagow，G。（1991）。蓝色原生电泳用于分离酶活性形式的膜蛋白复合物/a>。 Anal Biochem 199（2）：223-231。

Zhelyazkova，P.，Sharma，CM，Forstner，KU，Liere，K.，Vogel，J.和Borner，T。（2012）。大麦叶绿体的主要转录组：许多非编码RNA和质体编码的RNA聚合酶的主导作用。植物细胞 24（1）：123-136。

Zhu，H。（2012）。蔗糖梯度分析。生物协议 Bio101：e194。