材料和试剂

15ml聚丙烯离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339650），
1.5ml微量离心管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-175-C）
T25聚苯乙烯组织培养处理的烧瓶（Nest Biotechnology，目录号：707003）
T75聚苯乙烯组织培养处理的烧瓶（Nest Biotechnology，目录号：708003）
带有Ultracel-3膜的Amicon Ultra-0.5ml 3-kDa离心过滤器（Merck Millipore Corporation，目录号：UFC500324）
50ml聚丙烯离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339652），
用于生长5和10 ml培养物的玻璃试管
96孔聚苯乙烯板（Sigma-Aldrich，产品号：M2936）
0.5mm直径的玻璃珠（Bio Spec Products Inc，目录号：11079105）
2ml聚丙烯珠粒小瓶（Bio Spec Products Inc，目录号：10831）
耻垢分枝杆菌 mc ² 155（ATCC，目录号：700084）
< em>牛分枝杆菌BCG（ATCC，目录号：35734）
Middlebrook 7H9培养基（BD Biosciences，目录号：271310）
甘油（Thermo Fisher Scientific，目录号：17904）
硫酸镁（Merck Millipore Corporation，目录号：105886）
吐温80（Sigma-Aldrich，产品编号：P4780）
7H9-甘油 - 吐温80培养基
油酸/白蛋白/葡萄糖/过氧化氢酶（OADC）生长补充剂（BD Biosciences，目录号：211886）
Bradford试剂（Sigma-Aldrich，目录号：B6916）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：A144SI-212）
cAMP ELISA试剂盒（Enzo Lifesciences，目录号：ADI-900-067）
cAMP直接免疫测定试剂盒（Abcam plc，目录号：ab65355）
循环AMP竞争性ELISA试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：EMSCAMPL）
氯化钠（Merck Millipore Corporation，目录号：1064040500）
氯化钾（Merck Millipore Corporation，目录号：1049360500）
磷酸氢二钠（Merck Millipore Corporation，目录号：1065860500）
磷酸二氢钾（Merck Millipore Corporation，目录号：1048730250）
三（羟甲基）氨基甲烷（Merck Millipore Corporation，目录号：1083820500）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，产品号：M6250）
苯甲基磺酰氟（Sigma-Aldrich，产品编号：PMSF-RO ROCHE）
磷酸盐缓冲盐水（见配方）
裂解缓冲液（见配方）

设备

注意：培养牛分枝杆菌BCG 需要生物安全2级（BSL 2）

37℃培养箱（加湿的）/振荡器（N-BIOTEK，型号：NB-203QR/Eppendorf，New Brunswick ，型号：40）
分光光度计（Eppendorf，BioPhotometer ，型号：D30）
装备有TX-400摇摆转子（Thermo Fisher Scientific，型号：TX-400）的冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific，Heraeus？sup？Megafuge TM型号：16R）适配器（数字20& 23）
微量离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：MicroCL 17R）
Vortexer（Bio-rad，型号：BR-2000）
读板器（读入可见光谱，包括405和595nm）（Tecan，Infinite ，型号：m200 PRO）
Bead beater（BioSpec Products，型号：Mini-Beadbeater-16）
加热块（加热至95°C）（NeoLab）
超低温冷冻箱（Panasonic，型号：MDF-U33V-PE）

软件

GraphPad Prism 5

程序

培养M.耻垢
1. 接种50微升的M.来自甘油储备液[在7H9-甘油-Tween 80培养基中的32.5％甘油（v/v）和50mM MgSO 4]中的耻垢分枝杆菌mc 2 155菌株] 5ml补充有0.2％甘油和0.05％吐温80的Middlebrook 7H9培养基，并在37℃下以200rpm振荡生长直到培养物达到饱和（OD 600?4，通常需要3-4天）。这种培养物作为主要的接种物
2. 将补充有0.2％甘油的Middlebrook 7H9培养基接种10ml（对数期，OD 600±1）和5ml（对于稳定期，OD 600?3） 0.05％Tween 80与初级接种物混合，使得起始OD 600为0.05，并在37℃下以200rpm振摇生长。
3. 一旦10ml培养物达到OD 600?1（通常需要?14小时），通过在15ml离心机中以3,000xg离心10分钟来沉淀9ml培养物管在4℃。收集1毫升培养上清液在1.5毫升微量离心管，并保存在冰中。小心地将细胞沉淀放在冰上，并彻底清除剩余的上清液
4. 当5ml培养物达到OD 600-3（通常需要?18-20小时）时，通过在15℃以3,000xg离心10分钟沉淀3ml培养物ml离心管在4℃。收集1毫升培养上清液在1.5毫升微量离心管，并保存在冰中。小心地将细胞沉淀放在冰上，并彻底清除剩余的上清液
培养M. bovis BCG
1. 接种50微升的M.来自甘油储液[在7H9-甘油-Tween 80-OADC培养基中的32.5％甘油（v/v）和50mM MgSO 4]的牛血清/牛血清BCG）的5ml Middlebrook 7H9培养基％甘油和含有10％（v/v）OADC的0.05％吐温80中，并在37℃下在加湿培养箱中作为静态培养物生长。一旦培养物达到饱和（OD <600> 4，通常需要12-14天），将其用作主要接种物。
2. 接种补充有0.2％甘油的Middlebrook 7H9培养基（对数期，OD 600±1）和10ml（对于稳定期，OD 600?3） 0.05％吐温80（含有10％（v/v）OADC）与初级接种物混合，使得在T75和T25组织培养烧瓶中的起始OD 600为0.1。在37℃下在湿润的培养箱中作为静态培养物生长
3. 一旦20ml培养物达到OD 600-1（通常需要?7-8天），通过在50℃下以3,000xg离心10分钟沉淀18ml培养物ml离心管在4℃。收集1毫升培养上清液在1.5毫升微量离心管，并保存在冰中。小心地将细胞沉淀放在冰上，并彻底清除剩余的上清液
4. 当10ml培养物达到OD 600?3（通常需要?14-15天）时，通过在15℃以3,000xg离心10分钟来沉淀6ml培养物ml离心管在4℃。收集1毫升培养上清液在1.5毫升微量离心管，并保存在冰中。小心地将细胞沉淀放在冰上，并彻底清除剩余的上清液
在胞质部分中分离游离和结合的cAMP（对于耻垢分枝和牛 BCG都是相同的）
1. 加入400微升冷磷酸盐缓冲盐水的细胞沉淀和重悬细胞通过涡旋或吸移上下数次。将细胞悬液转移到新的1.5 ml微量离心管中
2. 通过在4℃下以3000xg离心10分钟来沉淀细胞，并丢弃上清液。
3. 重复洗涤步骤一次，如步骤C1和C2
4. 将细胞重悬在400μl裂解缓冲液中
5. 将约0.3g玻璃珠添加到新的珠打孔小瓶中，并将细胞悬浮液分别转移到小瓶中。将珠子小瓶保持在冰上。
6. 裂解细胞通过珠打（30秒脉冲与3,450振荡/分钟，6次）。在每次珠磨循环之间保持瓶子在冰上。
7. 在4℃下将珠子在1000×g下离心1分钟，并将裂解物转移到新的1.5ml微量离心管中。
8. 在4℃下以17,000×g离心裂解物20分钟。转移上清液到一个新的1.5毫升微量离心管，并保持在冰。这作为胞质部分。
9. 可以使用基于微板的Bradford方法（也可以使用任何其他方法）测量胞质部分中的蛋白质浓度。牛血清白蛋白（BSA）用作Bradford测定中的标准品
10. 将对应于400μg蛋白的细胞溶质级分转移到Amicon 0.5ml 3kDa截止离心过滤器，并在4℃下以14,000×g离心10-15分钟。收集40μl滤液，转移到新的1.5ml微量离心管中，加入等体积的0.2N HCl（终浓度0.1N）。在加热块中在95℃下加热样品10分钟，并储存在-70℃下直到cAMP测量。该部分将提供胞质部分中的"游离"cAMP浓度注意：如果在稍后的时间点进行cAMP测量，则样品可以在95℃加热后储存在-70℃。否则，样品可以直接用于测量cAMP后加热。
11. 在新的1.5ml微量离心管中收集40μl纯胞质部分（来自步骤C8）并加入等体积的0.2N HCl（终浓度0.1N）。在加热块中在95℃下加热样品10分钟，并储存在-70℃下直到cAMP测量。该部分将提供胞质部分中的'总'cAMP浓度
在培养上清液中分离游离和结合的cAMP（对于耻垢分枝杆菌和牛分枝杆菌 BCG是相同的）
1. 将400μl先前收集的培养物上清液（参见步骤中的步骤A3和A4，B4和B5）转移到Amicon 0.5ml 3kDa截止离心过滤器中，并在14,000×g离心10-15分钟4℃。收集150μl滤液，转移到新的1.5ml微量离心管中，加入等体积的0.2N HCl（终浓度0.1N）。在加热块中在95℃下加热样品10分钟，并储存在-70℃下直到cAMP测量。该级分将在培养上清液中提供"游离"细胞外cAMP浓度
2. 转移150微升培养上清液（从步骤A3和A4，B4和B5）到一个新的1.5毫升微量离心管，加入等体积的0.2 N HCl（终浓度0.1 N）。在加热块中在95℃下加热样品10分钟，并储存在-70℃下直到cAMP测量。该部分将提供培养上清液中的"总"细胞外cAMP浓度
cAMP测量
1. 取适当的样品等分试样，并通过放射免疫测定（Dass等人，2008）或ELISA程序测量各级分中的cAMP浓度[试剂盒可以使用Enzo Lifesciences（ADI-900-067）， Abcam（ab65355）或Thermo Fisher Scientific（EMSCAMPL）]
2. 将'游离'（在步骤C11中收集的级分）和'游离'（在步骤C10中收集的级分）cAMP作为'pmoles cAMP /100μg蛋白'，计算细胞溶质'总'从"总"的浓度
3. 将在步骤D2中收集的细胞外"总"（在步骤D2中收集的部分）和"游离"（在步骤D1中收集的部分）cAMP表示为"pmoles cAMP ml sup-1"，并通过减去cAMP浓度在'游离'中的浓度与'总'的浓度

代表数据

图1. M中的自由和结合cAMP。耻垢。从M的对数期培养物测量游离（白色）和结合（灰色）cAMP水平。耻垢分泌物对于细胞内和细胞外部分。游离和结合水平的总和代表总cAMP。使用GraphPad Prism 5对三个生物重复绘制平均值的平均值和标准误差（SEM）。通过用N的平方根除以标准偏差（SD）计算SEM，其中N是独立测定的数目。 SD = ，其中是样本均值。

笔记

一旦细胞裂解，所有步骤应在4°C进行，样品在所有步骤之间保持冰
由于cAMP可随时间从蛋白质上解离，裂解后直到用Amicon膜过滤的步骤应该毫无延迟地进行。

食谱

磷酸盐缓冲盐水
0.8％NaCl
0.02％KCl
0.142％Na 2 HPO 4
0.024％KH 2 PO 4 sub/
裂解缓冲液
50mM Tris-Cl（pH8.2） 100 mM NaCl
10mM 2-巯基乙醇（2-ME） 10％（v/v）甘油 1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）

致谢

该协议改编自Banerjee等人中描述的原始方法。（Banerjee等人，2015）。 A.B.得到科学技术委员会高级研究奖学金的支持。印度政府工业研究。 S.S.V.是科学与工程学院J.C.Bose国家奖学金的接受者。技术，印度政府。这项工作得到印度政府生物技术司的支持。

参考文献

Banerjee，A.，Adolph，RS，Gopalakrishnapai，J.，Kleinboelting，S.，Emmerich，C.，Steegborn，C.and Visweswariah，SS（2015）。分枝杆菌中的通用胁迫蛋白（USP）结合cAMP。 J Biol Chem 290（20）：12731-12743。
Dass，BK，Sharma，R.，Shenoy，AR，Mattoo，R.and Visweswariah，SS（2008）。分枝杆菌中的环AMP：Rv1647直向同源物在耻垢分枝杆菌中的表征和功能作用 190（11）：3824-3834。
Shenoy，AR and Visweswariah，SS（2006）。新来自旧信使的消息：cAMP和分枝杆菌。趋势微生物 14（12）：543-550。