材料和试剂

细胞培养基
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
胎牛血清（FBS）
胰蛋白酶/EDTA（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：25200-056）
结晶紫（Sigma-Aldrich，目录号：C3886）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
冰乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：320099）
固定溶液
菌落固定溶液（见配方）
水晶紫溶液（见配方）

设备

细胞培养皿或六孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：08-772-1B）
血细胞计数器（Hausser Bright-Line）（Thermo Fisher Scientific，目录号：02-671-10）
立体显微镜（例如，Nikon Eclipse，型号：TS100）
血细胞计数器
孵化器

程序

细胞制备：
1. 根据需要（例如，GBM细胞系，U87，U251，SF188等）培养细胞。
2. 取出培养基，然后用10ml PBS冲洗细胞
3. 加入4毫升0.25％胰蛋白酶的细胞，并在37℃孵育1-5分钟，直到细胞出现圆形。
4. 加入10毫升含10％FBS的培养基，通过移液分离细胞
5. 使用血细胞计数器计数细胞注意：为单元格获取相对准确的数字至关重要。
6. 准备所需的播种浓度，然后种子细胞到菜或6孔板
测定设置：
可以在处理之前或之后对细胞进行电镀。
1. 治疗前电镀：
  1. 收获细胞并在6孔板上每个培养皿或每孔平板适当数量的细胞，至少一式两份。用于接种的细胞的数目应该通过处理的侵袭性来确定。在37℃的CO 2培养箱中孵育细胞数小时，并允许它们附着在平板/皿上。
  2. 根据需要用化学品（例如，，1-100μM），辐射（例如，2-10Gy）或两者的组合处理细胞。
  3. 将细胞在CO 2培养箱中在37℃孵育1-3周，直到对照板中的细胞形成具有基本上良好大小的菌落（每个菌落50个细胞是评分的最小值）。
2. 处理后电镀：
  1. 收获细胞后处理。可以电镀50个或高达50×10 4个细胞。准备连续稀释与不同数量的细胞，如果治疗的影响不清楚。对于放射治疗，可以在处理后立即电镀细胞或稍后重新电镀。在重新电镀之前，最好将细胞保存在冰上。
  2. 在CO 2培养箱中在37℃下孵育细胞1-3周，直到对照板中的细胞形成具有基本上良好大小的集落（每个集落50个细胞是评分的最小值）。
固定和染色：
1. 取出培养基，然后用10ml PBS冲洗细胞
2. 取出PBS，加入2-3 ml固定液，并将盘/板在室温（RT）下放置5分钟
3. 取出固定液。
4. 加入0.5％结晶紫溶液，在室温下孵育2小时
5. 加入10毫升含10％FBS的培养基，通过移液分离细胞
6. 小心地移除结晶紫，将盘/板浸入自来水中冲洗掉结晶紫
7. 在室温下将餐具/盘子放在桌布上风干几天。
数据分析：
1. 用立体显微镜计数菌落数。
2. 计算电镀效率（PE）和存活分数（SF） PE = no。的菌落形成/无。的细胞接种×100％
  SF = no。的处理后形成的菌落/的细胞接种x PE

食谱

菌落固定溶液
乙酸/甲醇1：7（vol/vol）
结晶紫0.5％溶液

致谢

此协议已从已发布的版本修改（Franken等人，2006年）。

参考文献

Franken，N.A.，Rodermond，H.M.，Stap，J.，Haveman，J.and van Bree，C.（2006）。体外细胞克隆形成测定。 Nat Protoc 1（5）：2315-2319。
Mueller，S.，Yang，X.，Sottero，TL，Gragg，A.，Prasad，G.，Polley，MY，Weiss，WA，Matthay，KK，Davidoff，AM，DuBois，SGand Haas-Kogan，DA 2011）。 HDAC抑制剂伏立诺他和放疗在转移性成神经细胞瘤中的合作：功效和基础机制。 Cancer Lett 306（2）：223-229。
Prasad，G.，Sottero，T.，Yang，X.，Mueller，S.，James，CD，Weiss，WA，Polley，MY，Ozawa，T.，Berger，MS，Aftab，DT，Prados，MD和Haas -Kogan，DA（2011）。抑制胶质母细胞瘤中的PI3K/mTOR途径以及与替莫唑胺的联合治疗的意义。 em> Neuro Oncol 13（4）：384-392