材料和试剂

10厘米培养皿
微量离心管
Eppendorf管
琼脂糖珠
U2OS细胞
HA-遍在蛋白质粒
FuGene 6转染试剂（Promega Corporation，FuGENE ，目录号：E2691）
还原血清培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：31985-070）
MG132
1x PBS
胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：25300）
IgG对照抗体根据靶向抗体种类[例如，兔IgG（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2027）]/
琼脂糖缀合物[例如，Protein A/G琼脂糖（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2003）]
BRCA1抗体
RIPA缓冲液（例如，Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-24948）
抗遍在蛋白或抗HA抗体
Tris-HCl
SDS
溴酚蓝
β-巯基乙醇
甘油
加载缓冲区（参见配方）

设备

管式旋转器位于4℃的冷室
离心机（Eppendorf，型号：5424/5424R）

程序

使用FuGene 6用HA-泛素质粒与其它感兴趣的质粒共转染U2OS细胞。对于10cm培养皿，将3μg质粒与18μlFugene 6在500μl还原型血清培养基中按照制造推荐程序混合用于Fugene 6.在代表性图像中，使用TUSC4敲低U2OS细胞。
在室温下温育混合物15-30分钟后，将混合物逐滴加入10cm培养皿的细胞培养基上。轻轻移动盘子，将混合物均匀地撒在盘子上
在48-72小时内收获细胞（10μMMG132孵育4-6小时，收获前是富集泛素化信号的任选步骤）。
按照标准Western印迹程序所述制备总细胞裂解物。简而言之，用1x PBS洗涤细胞，并用足以从培养皿分离细胞的体积的胰蛋白酶孵育细胞（例如，200μl）。使用RIPA缓冲液（例如，500μl）直接在培养皿上裂解细胞，然后将细胞转移到微量离心管中。
用温和超声处理（例如，3秒脉冲5次）破坏细胞。
在4℃下以10,000×g离心样品10分钟，然后将上清液转移到冰上的干??净微量离心管中，而不在底部转移细胞碎片。
（任选的减少非特异性结合的步骤）用合适的IgG小鼠对照抗体（例如，每1ml细胞裂解物中0.25μg抗体）预清洗细胞裂解物和20μl悬浮的琼脂糖缀合物例如Protein A/G琼脂糖），并将混合物在4℃下旋转30分钟至1小时。
在4℃下以1,000×g离心混合物1分钟，并将含有靶蛋白的上清液转移到干净的微量离心管中（典型量的蛋白质为2-5mg）。孵育样品与一级抗体的量，由制造商建议在4°C旋转2小时过夜。在代表性图像中，使用BRCA1抗体（Lu等人，2012）。
加入20微升适当的琼脂糖珠，孵化样品在4°C旋转1-2小时
在4℃下将琼脂糖珠子在1,000×g下旋转1分钟，弃去上清液，小心不要打扰珠子。
用RIPA缓冲液或PBS洗涤珠子3次，在4℃下恒定旋转，每次15分钟。 RIPA缓冲液是相对强的洗涤剂，其可以破坏蛋白质 - 蛋白质相互作用;可以考虑替代的洗涤剂用于较弱的蛋白质 - 蛋白质相互作用。在最后一次洗涤后，尽可能多地除去珠子的最少破碎的缓冲液。
注意：在某些情况下，RIPA会过于苛刻，因此需要根据情况进行调整。
加入20-50微升的加载缓冲液，并混合重新悬浮珠。在95°C孵育样品5分钟，然后进行SDS-PAGE分析或存储在-20°C的样品以备将来使用。在代表性图像中，使用10％凝胶。常规的蛋白质印迹条件是足够的;由于在免疫沉淀步骤期间非特异性结合可能引起的高背景，一些印迹可能需要延长洗涤。
可以使用抗泛素或抗HA抗体探测印迹以确定初级蛋白的泛素化水平。

代表数据

图1. TUSC4表达的敲低增强了BRCA1多聚泛素化，导致BRCA1蛋白质降解

NPRL2/TUSC4敲低增加了BRCA1与对照细胞（在MG132富集用于泛素化后）的泛素化水平（Peng等人，2015）。

笔记

用适当的IgG对照抗体预清晰的细胞裂解物是减少背景信号的必要步骤。

食谱

加载缓冲区
62.5mM Tris-HCl（pH6.8）
2.5％SDS
0.002％溴酚蓝
0.7135M（5％）β-巯基乙醇 10％甘油

致谢

这项工作是由国防部（DOD）乳腺癌研究计划（BCRP）希望学者时代的支持（W81XWH-10-1-0558; S.-Y.林）。

参考文献

Lu，Y.，Li，J.，Cheng，D.，Parameswaren，B.，Zhang，S.，Jiang，Z.，Yew，PR，Peng，J.，Ye，Q.，Hu，）。 F-box蛋白FBXO44介导BRCA1泛素化，降解。 J Biol Chem 287：41014-22。
Peng，Y.，Dai，H.，Wang，E.，Lin，C.C.，Mo，W.，Peng，G.，Lin，（2015）。 TUSC4通过调节作用作为肿瘤抑制剂BRCA1 Stability。 Cancer Res 75（2）：378-86