材料和试剂

直径15μm的Monodur尼龙过滤器（Filtravibracion S.L.，目录号：尼龙-15）
无菌塑料漏斗（直径80mm）（Tecnylab，目录号：45000150）
Eppendorf管
无菌刮刀（InstrumentaciónCientífica，S.L.，目录号：2004NE8044）
微量滴定板（TermoFisher Scientific，目录号：2205）
透析膜，截留12kDa（Sigma-Aldrich，目录号：D9527-100FT）
<尖孢镰刀菌 f.sp.来自野生型（J.Tello，Universidad de Almeria，Spain），Δcon7-1和cΔ con7-1 的微结实悬浮液突变株（Ruiz-Roldan等人，2015）
甘油（Merck，目录号：104092）
马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB）（Scharlau，目录号：01483）
甲壳素（Sigma-Aldrich，目录号：C6137）
Bio-Rad蛋白质测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad，目录号：500-0006）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：10 735 078 001）
聚乙二醇35,000（Sigma-Aldrich，目录号：81310）
（Merck，目录号：1.06586.0500）。
NaH 2 PO 4一水合物（Merck，目录号：567549）
MgSO 4·7H 2 O（Merck，目录号：1058865.5000）
（Merck，目录号：104873.1000）
KCl（Merck，目录号：104933.0500）
（Merck，目录号：1.01187.1000）
（Merck，目录号：103965.0500）
ZnSO 4·7H 2 O（Merck，目录号：108883）
MnSO 4·一水合物（Merck，目录号：105941）
葡萄糖（Coger SAS，目录号：24379.363）
NaCl（Merck，目录号：1.06404.5000）
荧光几丁质酶测定试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：CS1030）。内容：

测定缓冲液（25ml）（Sigma-Aldrich，目录号：A8730）
4-甲基伞形基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷（5mg）（Sigma-Aldrich，目录号：M2133）
4-甲基伞形基β-D-N，N'-二乙酰壳磷酸水合物（5mg）（Sigma-Aldrich，目录号：M9763）
4-甲基伞形基β-D-N，N'，N" - 三乙酰基壳三糖（5mg）（Sigma-Aldrich，目录号：M5639）
来自绿色木霉的几丁质酶（1mg）（Sigma-Aldrich，目录号：C6242）
4-甲基伞形酮标准溶液，50mg/ml（1ml）（Sigma-Aldrich，目录号：M3570）
碳酸钠（2g）（Sigma-Aldrich，目录号：S2127）
二甲基亚砜（DMSO）（1ml）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）

0.05 M磷酸盐缓冲液（见配方）
合成介质（SM）（参见配方）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）
Strate储液（20 mg/ml）（参见配方）
Strate工作解决方案（参见配方）
几丁质酶控制酶（参见配方）
停止溶液（碳酸钠溶液）（参见配方）
4-甲基伞形酮标准溶液（参见配方）

设备

血细胞计数器（Thoma）（Marienfeld，目录号：06 40710）
Mini-BeadBeater-16匀浆器（BioSpec Products）
砂浆和杵
轨道孵化器摇动（Infors，型号：Multitron Pro）
微量离心机（Eppendorf MiniSpin plus，Fisher Scientific）
荧光计（SpectraFluorPlus，TECAN，目录号：F129005）
水浴（Selecta，目录号：6000138）
Vortex（IKA，型号：MS2 Minishaker）

程序

样品制备
1. F。尖孢镰孢将 lycopersici 菌株在-80℃下与30％甘油一起保存为微量悬浮液。
2. 对于新鲜的小分生孢子生产，将冷冻的小分生孢子储备液的等分试样接种到100ml马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）中，并在轨道培养箱中在150rpm和28℃下孵育3天。然后通过置于漏斗上的Monodur尼龙过滤器过滤培养物以分离菌丝体（图1A），并在3,020×g离心5分钟以收集微小分生孢子。最后，将含有新鲜微小分生孢子的沉淀重悬于1ml无菌dH 2 O中，并使用血细胞计数器计数。
  
  图1.过滤和菌丝体收获程序。A.通过置于漏斗上的Monodur尼龙膜过滤真菌培养物。 B.随后通过使用刮刀刮尼龙膜收获菌丝体
3. 将来自每个菌株的含有4×10 8个新鲜微小分生孢子的等分试样接种到100ml PDB中，并在28℃的轨道培养箱中以170rpm振荡孵育14小时（野生型和cΔ< con7-1 株）或24小时（Δ con7-1突变体）。
  注意：与野生型或cΔcon7-1菌株相比， con7-1 突变体的分生萌发显着延迟。为了使突变体的生长延迟标准化，对该菌株使用更长的孵育期。
4. 通过Monodur尼龙膜过滤收获胚芽（图1A），用无菌蒸馏水洗涤两次，使用刮刀从尼龙过滤器刮下（图1B），并直接转移到含有0.5％甲壳素的合成培养基（SM）碳源。
5. 生长24小时后，过滤培养物上清液（以分离菌丝体）并离心（丢弃孢子）（如步骤A2中所述）。上清液用于测定分泌的几丁质酶活性，而菌丝体用于细胞内几丁质酶活性测量。
6. 将培养物上清液导入透析膜，使用塑料夹在两端密封，然后浸没在5L蒸馏水中，在4℃下透析14小时。
  注意：透析步骤是必要的，以消除培养基中残留的盐和营养物。
7. 透析后，将膜转移到塑料盘中，用PEG 35,000的粉末覆盖，并在4℃孵育直至它们被浓缩100倍（图2）。将样品储存在-20℃直至使用
  
  图2.使用PEG 35,000 的培养上清液的浓度
8. 将来自步骤A5的菌丝体用无菌蒸馏水洗涤两次，在-80℃冷冻，并用研钵和杵在液氮下研磨。
9. 将样品转移到含有1ml磷酸盐缓冲液（0.05M，pH 6.0）的Eppendorf管中，并通过涡旋匀化，然后在4℃温育2分钟。
10. 将匀浆在10,000×g和4℃下离心30分钟，收集上清液并储存在-20℃。
蛋白质含量的定量
根据Bradford（Bradford，1976）的方法，使用具有牛血清白蛋白的Bio-Rad蛋白测定试剂盒作为标准，定量培养物上清液和菌丝体的蛋白质含量。
1. 标准曲线
2. 样品分析
酶活性测定
根据制造商的说明书，使用荧光几丁质酶测定试剂盒单独定量内切和外切蛋白酶活性。该试剂盒提供三种不同的底物用于检测各种类型的壳聚糖活性：
4-甲基伞形基β-D-N，N'-二乙酰基壳多糖，适用于外壳脂酶活性检测（壳寡糖苷酶活性）的底物
4-甲基伞形基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷，适用于外切蛋白酶活性检测（N-乙酰氨基葡糖苷酶活性）的底物
适用于内切脂酶活性检测的4-甲基伞形基β-D-N，N'，N" - 三乙酰基壳三糖 - 底物
几丁质酶活性表示为每μg蛋白质从底物释放的μg的4-甲基伞形酮。在两个独立实验中进行测定，每个实验包括两个重复。
1. 溶液的制备（参见配方4-8）
2. 测试
  几丁质酶水解在酸性环境（pH?5.0）中在37℃下进行。酶水解释放4-甲基伞形酮（4MU）。在碱性pH中使用荧光计在360nm激发和450nm发射下测量释放的4MU的荧光。为了定量总的壳聚糖活性，应当用试剂盒中提供的三种底物进行单独的反应。注意，在粗制剂中，可能存在不同几丁质酶的添加/增效活性（即，4-甲基伞形基N，N'-二乙酰基硫代乙酰胺可被β-N-乙酰氨基葡糖苷酶和壳聚糖酶切割）。建议重复进行测定。
  对于每种底物，根据制造商的以下说明书进行单独的活性测定：
3. 计算
  单位定义：一个单位的几丁质酶活性将在pH 5.0，37℃下每分钟从适当的底物中释放1mM的4-甲基伞形酮。
  几丁质酶活性可以使用从5种标准溶液（参见表1）的荧光读数制备的标准曲线计算。
  或者，几丁质酶活性可以仅使用单一标准浓度计算。建议测量100 ng（1.9 nmole/ml）标准品的荧光，然后使用以下公式：
  
  其中：
  F _{sample =测试样品的荧光 F空白} =空白（仅含底物工作溶液）的荧光
  0.3 =加入终止溶液后的最终反应体积（毫升）
  DF =酶稀释因子
  F标准 =标准溶液的荧光减去标准空白的荧光时间=分
  V sub =样品体积，单位为毫升
  最后将得到的活性与前面步骤中每个样品计算的蛋白质量相比较

代表数据

图3显示了遵循该协议获得的数据的代表性实例
图3.细胞内和细胞外几丁质酶活性的定量从野生型菌株（wt），Δcon7con7-1突变体的种系获得胞内和胞外蛋白质提取物和在补充有0.5％甲壳质的SM中生长后的cΔ con7-1 补充菌株。使用荧光几丁质酶测定试剂盒测量内切和外切肽酶（壳聚糖酶和β-N-乙酰氨基葡糖苷酶）活性。特异性几丁质酶活性表示为从适当底物每μg蛋白质释放的μg的4-甲基伞形酮（4MU）。条带表示从两个独立实验计算的标准误差，每个具有两个重复（取自Ruiz-Roldan等人，2015）。

食谱

0.05 M磷酸盐缓冲液（pH 6.0）准备以下解决方案：
1. 1M Na 2 HPO 4（14.2g，在100ml蒸馏水中）
2. 1M NaH 2 PO 4·H 2 O（13.8g，在100ml蒸馏水中）
混合12ml溶液A和88ml溶液B
稀释至0.05 M最终浓度
合成介质（SM）
0.2g/L MgSO 4·7H 2 O·h/v 0.2g/L KH 2 PO 4
0.2 g/L KCl
1g/L NH 4 NO 3 0.01g/L FeSO 4
0.01g/L ZnSO 4 7H·7H 2 O 0.01g/L MnSO 4·H 2 O·m / 10g/L葡萄糖溶解在去离子水中，高压灭菌
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
8g/L NaCl
0.2 g/L KCl
1.44g/L Na 2 HPO 4
0.24g/L KH 2 PO 4 sub/
将上述试剂溶于800ml H 2 O中。用HCl调节pH至7.4，然后将H 2 O加至1L
条件储备溶液（20mg/ml）
1. 向每个合适的底物瓶的内容物（5mg）中加入0.25ml DMSO：
  4-甲基伞形基N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷，或
  4-甲基伞形基β-D-N，N'-二乙酰基硫代乙酰水合物，或
  4-甲基伞形基β-D-N，N'，N" - 三乙酰基壳三糖
2. 涡旋直至溶解
注意：4-甲基伞形基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷4-甲基伞形基β-D-N，N'，N" - 三乙酰基壳三糖不容易溶解在DMSO中。混合15分钟，在室温下涡旋，然后在37℃下以170rpm振荡孵育至多2小时，直到它们完全溶解。等分底物溶液，并保持在-20°C。
Strate工作解决方案
1. 恰好在测定之前，用测定缓冲液将底物储备溶液（20mg/ml）的等分试样稀释40倍至0.5mg/ml的浓度。
2. 通过涡旋混合。每次测试需要大约100μl底物工作溶液（每个孔）。
注意：如果需要，底物工作溶液中的底物浓度可以降低到0.2mg/ml。
几丁质酶控制酶

向几丁质酶瓶的内容物中加入5ml PBS，得到0.2mg/ml的最终几丁质酶浓度。
涡旋直至溶解。几丁质酶立即溶解，得到轻微浑浊的溶液。对于长期储存，等分试样储存在-20℃下（在-20℃下稳定至少3个月）。
使用前，用PBS稀释几倍的几丁质酶200倍，每次测定使用10μl稀释的酶。

停止溶液（碳酸钠溶液）

向碳酸钠瓶的内容物中加入47.2ml超纯水，用磁力搅拌器充分混合，直至完全溶解。
将停止溶液储存在室温下。

4-甲基伞形酮标准溶液
在进行测定之前，稀释停止溶液中的4-甲基伞形酮（4MU）标准溶液的等分试样。准备100-，1,000-和10,000-倍稀释至终浓度分别为500,50和5μg/ml。在测定中稀释的标准溶液的最终体积不应超过10μl。

致谢

这项研究得到了西班牙经济部长（BIO2013-47870，Ramon y Cajal计划）和安达卢西亚共和国（P11-CVI-7319）的支持。

参考文献

Bradford，MM（1976）。快速敏感的方法用于利用蛋白质 - 染料结合原理定量微克量的蛋白质。 Anal Biochem 72：248-254。
Di Pietro，A。和Roncero，MI（1998）。克隆，表达和在编码血管枯萎病原体尖孢镰刀菌的主要细胞外内聚半乳糖醛酸酶的pg1的致病性中的作用。 Mol Plant Microbe Interact 11（2）：91-98。
Pareja-Jaime，Y.，Martin-Urdiroz，M.，Roncero，MI，Gonzalez-Reyes，JA和Roldan Mdel，C。（2010）。尖镰孢的壳多糖合酶缺陷突变体引起番茄植物防御反应并保护免受野生型感染。/a> Mol Plant Pathol 11（4）：479-493。
Ruiz-Roldan，C.，Pareja-Jaime，Y.，Gonzalez-Reyes，JA和MI，GR（2015）。转录因子Con7-1是尖孢镰刀菌中形态发生和毒力的主要调节剂 Mol植物微生物Interact 28（1）：55-68。
Takaya，N.，Yamazaki，D.，Horiuchi，H.，Ohta，A.and Takagi，M.（1998）。来自根霉菌的细胞内几丁质酶基因：分子克隆和表征。微生物学 144（Pt 9）：2647-2654。