材料和试剂

具有50kDa MWCO的Amicon Ultra-4离心过滤器单元（Merck Millipore Corporation，目录号：UFC805096）
HisTrap HP柱（GE Healthcare，目录号：29-0510-21）
StrepTrap HP柱（GE Healthcare，目录号：29-0486-53）
空SPE管，12ml（Sigma-Aldrich，目录号：57176）
Visidry Female Luer Plug（Sigma-Aldrich，目录号：57098）
用于12ml SPE管（Sigma-Aldrich，目录号：52174-U）的帽
15厘米细胞培养皿
Spectra/Por 3透析膜（MWCO 3.5kD），45mm宽（VWR International，目录号：734-0686）
10用于透析管的夹具：Spectra/Por Closures，55mm（Spectrum，目录号：132737）
0.2μm注射器过滤器（Filtropur S加0.2）（Sarstedt AG，目录号：83.1826.102）
0.2μm瓶顶真空过滤系统（Vakuumfiltration 1000"rapid"Filtermax）（TTP，目录号：99950）
HEK293，HEK293T或HKB11细胞
MES钠盐（AppliChem GmbH，目录号：A3101）
MES一水合物（AppliChem GmbH，目录号：A4730）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
MOPS（AppliChem GmbH，目录号：A1076）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9451）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：306568）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：71380）
柠檬酸钠二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：W302600-K）
柠檬酸（Sigma-Aldrich，目录号：251275）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
MnCl 2·4水合物（AppliChem GmbH，目录号：A2087）
MgCl 2·6H 2 O（AppliChem GmbH，目录号：A4425）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
磷酸二氢钠一水合物（NaH 2 PO 4）（AppliChem GmbH，目录号：A1047）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
盐酸盐（Tris-HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：T5941-500G）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898）
咪唑（AppliChem GmbH，目录号：A1073）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P7949）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
叠氮化钠（AppliChem GmbH，目录号：A1430）
D（+） - 乳糖一水合物（AppliChem GmbH，目录号：A0880）
1M Tris，pH8.8（AppliChem GmbH，目录号：A4265）
d-Desthiobiotin（Sigma-Aldrich，目录号：D1411-500MG）
青霉素和链霉素，液体（Thermo Fischer Scientific，Gibco ^TM，目录号：15070-063）
UDP-半乳糖（Merck Millipore Corporation，Calbiochem ，目录号：670111-50MG）
CMP-唾液酸（Merck Millipore Corporation，Calbiochem ，目录号：233264-5MG）
StarGate ^? pCSG-IBA-144受体载体（IBA，目录号：5-5144-001）
StarGate ^?转移试剂盒（IBA，目录号：5-1603-001）
Western阻断试剂溶液（Sigma-Aldrich，目录号：11921673001）
来自产气荚膜梭菌的神经氨酸酶，在E中重组表达。大肠杆菌（New England Biolabs，目录号：P0720S）
来自肺炎链球菌的β1-4-半乳糖苷酶，在E中重组表达。大肠杆菌（Merck Millipore Corporation，Calbiochem ，目录号：345806-50MIU）
DMEM高葡萄糖（4.5g/L）（Thermo Fischer Scientific，Gibco ^TM，目录号：11965092）
用于快速流动的蛋白G琼脂糖凝胶（GE healthcare，目录号：17-0618-01）
20μM聚乙烯（PE）玻璃料（Sigma-Aldrich，目录号：57181）
生物素化的透明凝集素（LCA）（Reactolab，目录号：B-1045）
生物素化的Erythrina Cristagalli凝集素（ECL）（Reactolab，目录号：B-1145）
生物素化接骨木树皮凝集素（接骨木花凝集素，SNA）（Reactolab，目录号：B-1305）
琼脂糖结合的接骨木果胶（SNA），Vector Laboratories（Reactolab，目录号：AL1303）
链霉亲和素-HRP（Mabtech，目录号：3310-9）
MEM NEAA（非必需氨基酸）100x（Thermo Fischer Scientific，Gibco ^TM，目录号：1140050）
丙酮酸钠溶液（100mM）（Sigma-Aldrich，目录号：S8636）
Pierce ^TM ECL Western Blotting Substrate（Thermo Fischer Scientific，目录号：32106）
SuperSignal ^TM West Pico Chemiluminescent Substrate（Thermo Fischer Scientific目录号：34080）
一般

Tris缓冲盐水（TBS）（见Recipes）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见配方）

用于重组糖基转移酶的纯化

293，293T和HKB11细胞培养基（见配方）
293，293T和HKB11细胞蛋白表达培养基（参见Recipes）
2x HEPES缓冲盐水（HeBS）（参见Recipes）
2.5 M CaCl 2（参见配方）
Sterp-trap柱洗脱缓冲液（参见配方）
His-trap洗脱缓冲液（参见配方）
His-trap洗涤缓冲液（参见配方）
His-trap上清液稀释缓冲液（参见配方）

用于酶促半乳糖基化

半乳糖基转移酶缓冲液（参见配方）

用于酶促唾液酸化

唾液酸转移酶缓冲液（参见配方）

用于使用SNA-琼脂糖富集高度唾液酸化的抗体

SNA-琼脂糖结合/洗涤缓冲液（参见配方）
SNA琼脂糖洗脱缓冲液（参见配方）
SNA琼脂糖清除缓冲液（参见配方）
0.08％NaN 3 （参见配方）

用于使用重组神经氨酸酶的脱唾液酸化

神经氨酸酶缓冲液（见配方）

用于使用重组β1-4-半乳糖苷酶的去半乳糖基化

β1-4-半乳糖苷酶缓冲液（参见配方）

用于使用重力流动蛋白-G琼脂糖柱来纯化糖修饰的抗体

蛋白G柱洗脱缓冲液（参见配方）
蛋白G洗脱中和缓冲液（参见配方）

用于通过凝集素印迹分析抗体糖基化

凝集素印迹孵育缓冲液（参见配方）
凝集素印迹洗涤缓冲液（见配方）

设备

分光光度计（Thermo Scientific，NanoDrop，型号：1000）
台式离心机能够> 20,000×g离心并冷却至4℃（Eppendorf）
?KTAprimeplus（GE Healthcare，目录号：11-0013-13）
使用PowerPac TM基本电源（Bio-Rad，目录号：1658025FC）的用于1.0mm厚的手摇凝胶的Mini-PROTEAN Tetra TM垂直电泳槽4-凝胶，
Fusion FX7凝胶成像系统（Vilber，型号：Fusion FX7）

程序

重组糖基转移酶的纯化
为了获得纯的功能性唾液酸和半乳糖基转移酶，将各自的编码序列克隆到真核表达载体中。这些载体含有导致重组蛋白分泌的BM40信号序列以及用于从瞬时转染的真核细胞的细胞培养物上清液中纯化糖基转移酶的N-和C-末端亲和标签。
1. 将人ST6Gal1（NCBI参考序列：NP_003023.1;从氨基酸序列KEKKKGS直到GFRTIHC）和牛β1,4GalT（GenBank：AAI20416.1从氨基酸序列GSNLTSA直到VDIGTPS）的胞外结构域克隆到pCSG-IBA-144表达载体根据制造商的建议。这导致含有N末端双链Stag-标记和C-末端6x组氨酸标签的融合蛋白。
2. 用磷酸钙沉淀的质粒瞬时转染HEK293，HEK293T或HKB11细胞[改编自（Kingston，2003）]：
3. 使用HisTrap（镍亲和力）和StrepTrap TM（SII标签亲和力）柱纯化重组糖基转移酶
酶半乳糖基化
重组半乳糖基转移酶和UDP-半乳糖用于向抗体的IgG-Fc N-聚糖添加半乳糖。
1. 通过透析缓冲液交换抗体至0.2M MES pH 6.5。
2. 从透析中取出抗体，并将透析缓冲液储存在4℃以备后用。加入5μgβ1-4GalT/mg抗体，加入UDP-半乳糖至终浓度为10mM，MnCl 2至终浓度为20mM，并补充0.02％NaN 3，/sub>。
3. 在37℃孵育48小时。
4. 在4℃下离心2小时， 20,000 x g 删除聚合。
5. 使用重力流动蛋白G琼脂糖柱纯化半乳糖基化抗体或继续唾液酸化。半乳糖基化IgG的示意图显示于图3中
  
  图3.酶促糖基化IgG的示意图。从重组表达的IgG（上图，中心）的典型聚糖谱开始，在去半乳糖基化（上图，左）和半乳糖基化上图，右图）。在加入半乳糖后，唾液酸化导致末端唾液酸加到大多数半乳糖残基（下图，中心）。最后脱唾液酸化可用于除去唾液酸（下图，右）
酶唾液酸化
重组唾液酸转移酶和CMP-唾液酸用于向含半乳糖的IgG-Fc N-聚糖添加唾液酸。
1. 使用与用于（B）中的初始透析相同的缓冲液，在4℃下将整个半乳糖基化反应透析过夜至0.2M MES，pH 6.5。
2. 在4℃至25mM MOPS，100mM KCl，pH7.2透析过夜
3. 从透析中去除反应，并使用Nano-Drop确定蛋白质浓度。
4. 加入50μgST6Gal1/mg抗体和CMP-唾液酸至终浓度1.5mM
5. 在37℃孵育24小时。
6. 在4℃下透析至TBS过夜。
7. 使用重力流蛋白-G琼脂糖柱纯化抗体或使用SNA-琼脂糖富集高度唾液酸化的抗体。唾液酸化IgG的示意图显示于图3中
使用SNA-琼脂糖富集高度唾液酸化的抗体酶半乳糖基化的效率和特别是唾液酸化可以根据酶批次而变化。使用与Fc连接的聚糖区域中含有至少2个唾液酸残基的抗体特异性结合的琼脂糖结合的接骨木花青素凝集素（SNA）（Stadelmann等人， 2009）允许富集具有高唾液酸含量的抗体
1. 在含有20μm孔隙度的聚乙烯（PE）玻璃料的SPE管中倒入1-2ml SNA-琼脂糖，并使浆液沉降（这需要约5分钟）。在浆料顶部放置一块额外的PE玻璃料（图4）。
  
  图4.设置SNA琼脂糖重力流动柱
2. 用5个柱体积的TBS + 0.1M CaCl 2洗涤3次
3. 将CaCl 2加至预先用TBS透析的唾液酸化抗体的终浓度为0.1M。
4. 应用于SNA琼脂糖柱并收集流出物。
5. 重新将流量应用到列。
6. 用5个柱体积的TBS + 0.1M CaCl 2洗涤3次
7. 用5个柱体积的0.5M乳糖在TBS（SNA琼脂糖洗脱缓冲液）中洗脱，并收集相应于1个柱体积的洗脱液。
8. 用5个柱体积的0.5M乳糖/0.2M乙酸（SNA琼脂糖清除缓冲液）洗脱，并收集相应于1个柱体积的洗脱液。
  通过用10个柱体积的0.5M乳糖/0.2M乙酸，然后10个柱体积的TBS和5个柱体积的SNA琼脂糖储存缓冲液洗涤来再生柱。关闭柱的底部与母鲁尔插头，加入2毫升SNA琼脂糖储存缓冲液，并关闭顶部与SPE管帽。将色谱柱保存在4°C。
9. 将洗脱物透析到TBS。
10. 使用蛋白-G琼脂糖柱进行纯化
使用重组神经氨酸酶的脱唾液酸化
1. 将抗体透析至50mM柠檬酸钠，pH 6.0（神经氨酸酶缓冲液）
2. 每mg抗体加入70单位神经氨酸酶（或至少300U/ml）
3. 在37℃孵育48小时。
4. 使用蛋白-G琼脂糖纯化抗体。去唾液酸化的IgG的示意图显示在图3中
使用重组β1-4-半乳糖苷酶进行去半乳糖基化 β-1-4-半乳糖苷酶只能去除末端半乳糖（King等人，2006）。因此，如果抗体的IgG-Fc聚糖被唾液酸化，则必须首先进行神经氨酸酶处理
1. 将抗体透析至50mM磷酸钠缓冲液pH 6.0（半乳糖苷酶缓冲液）
2. 每100μg抗体加入6 mUβ1-4-半乳糖苷酶
3. 在室温下孵育6小时，然后在37℃下孵育1小时
4. 使用蛋白-G琼脂糖纯化抗体。去半乳糖基化IgG的示意图如图3所示
使用重力流动蛋白-G琼脂糖柱纯化糖修饰的抗体
该步骤用于除去在乙二醇修饰过程中加入的糖苷酶和/或糖基转移酶。在含有20μm孔隙度的PE玻璃料的SPE管中倒入蛋白-G琼脂糖浆（1-2ml，取决于待纯化的抗体的量）。在浆液沉降后（这需要约5分钟），在顶部插入另外的SPE玻璃料。该柱设置如图4中所示的SNA琼脂糖。
1. 通过重力流应用糖基化抗体
2. 用TBS广泛洗涤。
3. 用0.1M甘氨酸（pH2.5）洗脱，并将洗脱液收集在含有适量的1M Tris（pH8.8）的1ml管中，得到pH为7.4。
4. 透析到TBS或PBS。
通过凝集素印迹分析抗体糖基化使用重组生物素化凝集素的免疫印迹（称为凝集素印迹）可用于检测特定聚糖残基的存在。这是一种快速可靠的方法来确认抗体的乙二醇修饰。
1. 在10％聚丙烯酰胺凝胶上加载1到2μg的每种糖变体，并将蛋白转移到0.45μm的硝酸纤维素膜上。
  注意：在整个凝集素印迹过程中，避免膜的含蛋白质侧与其他表面接触，因为这将导致增加的背景信号，特别是用于使用生物素化SNA检测唾液酸。因此，在整个程序中为每个膜使用单独的托盘。
2. 用Western Blocking Reagent（在马来酸缓冲液中10％纯化的酪蛋白，在TBS中1:10稀释）在室温下封闭膜1小时或在4℃过夜。
3. 除去封闭溶液，加入相应的凝集素（ECL用于半乳糖，LCA用于甘露糖，SNA用于唾液酸），稀释度为1:1000（导致ECL为5μg/ml，LCA为5μg/ml， μg/ml用于SNA）在含有1mM CaCl 2，MgCl 2，MnCl 2和1％Western阻断试剂的TBS（凝集素孵育缓冲液）。
4. 在室温下孵育1小时
5. 用含有0.1％吐温20的TBS洗涤至少6×5分钟
6. 在室温下用含有1％西方阻断试剂和链霉亲和素-HRP（1：1,000）的TBS孵育1小时。
7. 用含有0.1％吐温20的TBS洗涤至少6×5分钟
8. 应用化学发光过氧化物底物，并使用凝胶成像系统或X射线胶片检测信号。 LCA和SNA使用Pierce ^TM ECL作为底物，ECL使用SuperSignal ^TM West Pico工作良好（图5）。
  
  图5.抗体糖基化的示例性凝集素印迹分析。显示在糖基化（未修饰）之后，在使用蛋白G琼脂糖（半乳糖基化）进行半乳糖基化和纯化后和在半乳糖基化后，293T细胞表达的Fc-人源化IgG1抗体，唾液酸化和使用蛋白G琼脂糖（唾液酸化）纯化。核心聚糖组分甘露糖的考马斯染色和免疫印迹分别用于确认纯度和相等的加载。 ECL仅检测末端半乳糖，因此唾液酸化后信号丢失

食谱

一般
1. Tris缓冲盐水（TBS）
  0.05M Tris-HCl
  0.15 M NaCl
  将pH调节到7.4
2. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）
  2.7 mM KCl
  8mM Na 2 HPO 4
  1.8mM KH 2 PO 4 sub/
  137 mM NaCl 将pH调节至7.4
用于重组糖基转移酶的纯化
1. 293，293T和HKB11细胞培养基 DMEM高血糖
  青霉素/链霉素（P/S，50U/ml） 1mM丙酮酸钠 10％胎牛血清
2. 293，293T和HKB11细胞蛋白表达培养基 DMEM高血糖
  青霉素/链霉素（P/S，50U/ml） 1x NEAA
  1mM丙酮酸钠 10％胎牛血清
3. 2x HEPES缓冲盐水（HeBS）
  0.28M CaCl 2
  0.05 M HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸） 1.5mM Na 2 PO 4/dn 用5M NaOH调节pH至7.05，并通过0.2μm过滤灭菌
4. 2.5 M CaCl 2/
  2.5M CaCl 2在ddH 2 O 2中的浓度
5. StrepTrap ^TM柱洗脱缓冲液
  2.5mM D-脱硫生物素的PBS溶液中
6. His-trap洗脱缓冲液
  300mM咪唑的PBS溶液，调节pH至7.4
7. 他的陷阱洗涤缓冲液
  20mM咪唑的PBS溶液，调节pH至7.4
8. His-trap上清液稀释缓冲液
  40mM咪唑的PBS溶液，调节pH至7.4
对于酶促半乳糖基化
1. 半乳糖转移酶缓冲液
  25 mM MOPS
  100 mM KCl
  用KOH调节pH至7.2
对于酶促唾液酸化
1. 唾液酸转移酶缓冲液
  0.2 M MES
  制备0.2M MES-钠盐溶液和0.2M MES一水合物溶液，并混合两种组分以达到pH6.5（这需要约两倍过量的MES-钠盐溶液）。
使用SNA-琼脂糖富集高度唾液酸化的抗体
1. SNA-琼脂糖结合/洗涤缓冲液
  TBS + 0.1M CaCl 2
2. SNA琼脂糖洗脱缓冲液
  0.5 M乳糖在TBS中将pH调节至7.5
3. SNA琼脂糖清除缓冲液
  0.5M乳糖在0.2M乙酸中的溶液
4. SNA琼脂糖贮存缓冲液
  10 mM HEPES
  0.15 M NaCl
  0.1mM CaCl 2/v/v 0.08％NaN 3
  20mM乳糖用NaOH调节pH至7.5
对于使用重组神经氨酸酶的脱唾液酸化
1. 神经氨酸酶缓冲液
  50 mM柠檬酸钠，pH 6.0
  用50mM柠檬酸调节pH至6
使用重组β1-4-半乳糖苷酶进行去半乳糖基化
1. β1-4-半乳糖苷酶缓冲液 50mM磷酸钠，pH 6.0
  制备50mM Na 2 HPO 4溶液和50mM NaH 2 PO 4 PO 4溶液，并混合两种组分达到pH 6.5（这需要约7倍过量的50mM NaH 2 PO 4）。
使用重力流动蛋白-G琼脂糖柱纯化糖修饰的抗体
1. 蛋白G柱洗脱缓冲液
  0.2 M甘氨酸用HCl
  调节pH至2.5
2. 蛋白G洗脱液中和缓冲液
  1M Tris，pH 8.8
用于通过凝集素印迹分析抗体糖基化
1. 凝集素印迹孵育缓冲液
  含有1mM CaCl 2，1mM MnCl 2，1mM MgCl 2和1％Western阻断试剂的TBS。
2. 凝集素印迹洗涤缓冲液
  TBS + 0.1％吐温20

致谢

我们感谢Falk Nimmerjahn博士（Erlangen-Nuremberg大学生物系，德国Erlangen）帮助建立这个协议，Patrick Weber（苏黎世大学Neuroinflammation实验免疫学研究所）为专家技术援助。 I. Quast由奥地利科学院（?AW）提供的DOC奖学金支持。该协议改编自Kingston，2003; Kaneko等人，2006; Anthony等人。，2008; Barb 。，2009; Quast 。，2015。

参考文献

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Anthony，RM，Nimmerjahn，F.，Ashli??ne，DJ，Reinhold，VN，Paulson，JC和Ravetch，JV（2008）。用重组IgG fc重现IVIG抗炎活性。 Science 320（5874）：373-376。
Barb，AW，Brady，EK和Prestegard，JH（2009）。通过ST6Gal-I的IgG-Fc聚糖的分支特异性唾液酸化。生物化学48（41）：9705-9707。
Kaneko，Y.，Nimmerjahn，F。和Ravetch，EV（2006）。由Fc唾液酸化产生的免疫球蛋白G的抗炎活性。科学 313（5787）：670-673。
King，SJ，Hippe，KR和Weiser，JN（2006）。通过由肺炎链球菌表达的外切糖苷酶的连续活性对人糖缀合物的糖基化。 Molecular Microbiology 59（3）：961-974。
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