材料和试剂

脱盐NAP5柱（，例如GE Healthcare，HiTrap Desalt，目录号：17-0853-01）
凝胶过滤柱
我们使用预包装的GE 10/300Tricorn柱，用于小可溶性蛋白的Superdex 75（GE Healthcare，目录号：17-5174-01）或用于脂质重建样品的Superose 6（GE Healthcare，目录号：17-5172 -01）。
蛋白质
注意：

感兴趣的金属结合蛋白必须以纯化的天然状态在手上，在实验之前聚集物已经被除去。
蛋白质应以毫克数量提供，并且应优选具有不同的分子量（这是凝胶过滤的先决条件）。
太小而不能在凝胶过滤柱上彼此区分的蛋白质可以与多肽标签例如麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶融合，以便人为增加金属离子转移的分子量差异对。
我们使用eGFP标签，因为其在氧化还原反应中相对惰性并且便于容易的检测和浓度测定。
对于蛋白质纯化方法，必须小心使用His标签。虽然已经证明His标签在某些条件下不干扰铜结合和定量实验（González-Guerrero等人，2008），但六聚组氨酸序列的金属螯合性质可能在一些实验中引起金属携带。/em>

（MOPS），缓冲级（Sigma-Aldrich，目录号：M1254）。
氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
抗坏血酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：11140）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：43815）
磷脂酰胆碱（PC）（Sigma-Aldrich，目录号：P3644）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L6026）
（BCS）（Sigma-Aldrich，目录号：B1125）
二辛可宁酸（BCA）（Sigma-Aldrich，目录号：D8284）
β-十二烷基麦芽糖苷（β-DDM）（Sigma-Aldrich，目录号：D5172）
硫酸铜（CuSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：451657）
缓冲区A（参见配方）
BCA铜缓冲液（见配方）
SDS溶液（见配方）
抗坏血酸溶液（参见配方）
BCS解决方案（参见配方）

设备

（可选）动态光散射仪器[例如，高性能粒度仪（Malvern Instruments，型号：HPP 5001或Zetasizer Nano S）]
用于制备脂质乳液的超声匀浆器（例如，BANDELIN electronic GmbH& Co，型号：UP 400S）
用于缓冲脱气的超声波浴（例如，BANDELIN electronic GmbH& Co，型号：Sonorex DL510H）
自动色谱单元（例如，GE Healthcare，?ktaPurifier或Explorer）
注意：这是实验必不可少的。使用具有级分收集器的常规HPLC装置将同样精细，条件是已经考虑了关于含盐洗脱缓冲液的耐受性的一些修改。
用于1.5ml类型反应小瓶（例如，Eppendorf，目录号：5384000012）的恒温摇动培养箱
离心蒸发器（例如，Eppendorf，目录号：5305000304）
校准的微量移液管（例如，Eppendorf，目录号：3120000062），或者：分析天平（例如，Mettler-Toledo International Inc.，目录号：11142056） />
UV-VIS分光光度计（例如，Jasco，型号：J-650）和Nanodrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific），或者：UV-VIS分光光度计和小体积比色皿（例如，Hellma，型号：105.250-QS或Eppendorf，μCuvette，型号：G1.0）
石英微池（，例如，Hellma，目录号：104-10-40 104-QS）
标准SDS-PAGE设备（例如，Bio-Rad Laboratories，目录号：1658001FC）

程序

蛋白质需要量

蛋白质的所需量取决于相对于其分子量，多少金属供体和受体蛋白结合。
使用100nM的每种供体和受体蛋白（1:1化学计量）是固体起始点。
可以使用较低的数量，但精度会降低。

蛋白氧化态

检查供体和受体蛋白质的推定的蛋白质金属结合位点的氧化敏感性：单价铜（除其他重金属离子种类之外）经常通过半胱氨酸硫醇协调，其在蛋白质制备期间易于氧化。在我们的实施例中，供体蛋白质MBD2以及受体蛋白质CopA具有涉及氧化敏感性半胱氨酸的铜结合位点（Fan和Rosen，2002; Fan等人，2001）。
在任一蛋白质的氧化敏感性的情况下，从1M储备溶液（一个可替代地尝试2-巯基乙醇或TCEP，但我们没有测试这些）添加DTT至5-20mM的浓度并孵育1小时。
随后通过使用NAP5柱的脱盐色谱通过缓冲液交换除去所有DTT（或者，HiTrap脱盐或PD10柱也将如此）。处理应根据制造商的说明进行。
此外，使用新鲜脱气的缓冲液（例如，使用为您感兴趣的蛋白质或缓冲液A建立的储存缓冲液）以避免再氧化是至关重要的。
脱盐后，立即进行实验，或在液氮中快速冷冻预处理的蛋白质

用金属载入供体蛋白（工作流程如图1所示）
1. 处于其二价状态（例如在CuSO 4中）的铜对于蛋白质是有害的，因为它吸附到生物表面并氧化酰胺键。因此，在Cu（II）盐的存在下通常观察到蛋白质沉淀。
2. 相反，Cu（I）盐是高度氧化还原活性的，并且几乎不溶于水性介质。因此，推荐通过有色低亲和力有机铜络合物，例如[BCA 2 sub-Cu（I）] 3+来加载供体蛋白。因此，供体蛋白质用BCA-铜缓冲液滴定，直到混合物不再消失，并保持特征性紫色。
图1.用于制备载有金属的供体蛋白的工作流程。用金属缓冲液（在这种情况下为BCA-铜缓冲液）滴定处于载脂蛋白状态的供体蛋白溶液。这种间接负载过程避免了蛋白质与过量铜的直接接触，从而保护其免受金属引起的损害。滴定少量步骤是有利的，因为其允许监测装载过程。在第一滴定步骤中没有脱色的情况下，供体蛋白质可能已经遭受损害或根本不能接受金属负载。一旦蛋白质溶液中存在过量的金属缓冲液，将混合物加载到尺寸排阻/脱盐柱（例如，NAP-5柱，在制造商的说明书后使用）上，得到载有金属的供体蛋白质不含游离金属或金属螯合剂的污染
重新净化供体蛋白

为了除去过量的BCA，使用用缓冲液A平衡的缓冲液交换柱再次纯化供体蛋白质（如步骤2c）。
洗脱的蛋白质不能含有任何蓝色染料（测量562nm处的吸光度）

光谱测定蛋白浓度

使用NanoDrop分光光度计和实验或预测的吸收系数测量负载的供体蛋白的浓度（Pace等人，1995）。
在受体蛋白质的浓度未知的情况下，应该在这一点同样量化

（可选）脂质乳剂制剂

在CopA的情况下，我们经历了重建成脂质相可能需要金属接受性。其他膜蛋白（González-Guerrero等人，2009）或可溶性蛋白质可能不需要这个步骤。
重构的最佳条件可以变化，并且需要对每种个别情况进行测试。
对于所提出的程序，均匀的囊泡大小是可取的。因此，通过超声处理10分钟（超声匀浆器，低强度浸渍探针）乳化10％（w/v）磷脂酰胆碱的脂质悬浮液。可以通过动态光散射仪来兼顾检查粒度分布

（可选）脂质重建
将10倍（w/w）过量的10％脂质悬浮液加入到限定量的蛋白质中，并在37℃下孵育20分钟并温和搅拌。
列平衡
用2倍柱体积的缓冲液A平衡凝胶过滤柱。同时在冰上储存供体和受体蛋白。
离子传输
以1：1至2：1的摩尔比混合供体和受体蛋白，并在室温下孵育5分钟，然后将缓冲液A加至总共500μl（用于GE Healthcare Tricorn 10/300柱）。
色谱
使用单位的自动注射器（500μl，在1ml样品环中）将蛋白质混合物应用于色谱柱，并使用0.2ml min -1 -1的流速和1ml级分大小开始洗脱超过30ml。增加的流速也将很好地工作，尽管导致更高的蛋白质稀释
保存色谱图UV和（如果有）电导率轨迹，它应如图2A所示。收集显示UV吸收的部分并储存以用于铜含量的后续分析（参见下文）。
分离的电泳控制
1. 可以从每个级分中取出10-50μl样品用于电泳分离分析（根据制造商的说明进行电泳）。
2. 如果供体和受体蛋白在层析期间形成稳定的复合物，应观察到不完全解离
3. 在转移期间的瞬时相互作用的情况下，两种蛋白质被良好分离（参见图2B）。
图2.凝胶过滤和电泳的示例性数据A.自动化色谱单元的典型UV吸收（黑色迹线）和电导率（灰色曲线）数据读出。该实施例显示使用Superose 6柱分离MBD2（供体）和脂质重建的CopA（受体）。相关峰针对其含量进行标记。 B.用于测试供体和受体蛋白质之间有效分离的SDS-PAGE是一个重要的对照实验，以排除供体（B级分）和受体（A级分）之间的复合物形成。
将级分转移至1.5ml聚丙烯小瓶中，并向每个级分加入40μlSDS-溶液[1％SDS（w/v）终浓度]。在65℃孵育并轻微搅拌，直到蛋白质或脂质 - 蛋白质乳液完全均匀化，并且溶液看起来澄清。这可能需要长达1小时。
冷却样品，并以1,000×g离心1分钟，收集管底部的整个液体。
记录每个样品的UV光谱。

检查在蛋白质吸收光谱下不存在非期望的散射曲线。
在分散的情况下，加入另外40μl的SDS溶液，孵育1小时并重新测量

（可选）如果预期的金属浓度低，可以使用离心蒸发器（"Speed Vac"）浓缩样品以提高灵敏度。我们经历，集中到300微升不会导致任何降水，但实际水平，样品量可以减少真的取决于具体的实验。
音量确定
通过使用校准的微量移液器或使用分析天平（假定密度1.02（500mM NaCl溶液），重量分析，由于密度失配引起的误差和移液管的精度在相同范围内）测量每个样品的精确体积。
金属含量的检测

注意，描述了用于不同金属离子的许多比色量化方法，其中一些在Xiao和Wedd（2010）的综述中提及。
对于铜，我们选择使用BCS，因为它在可见光范围内具有高的消光系数。向每个样品中加入1％抗坏血酸（v/v）和5％BCS溶液（v/v），并在室温下孵育5分钟。

测量每个样品在482nm的吸光度
数据分析
使用计算的（Pace et al。，1995）或实验消光系数计算蛋白质浓度。
使用13,000M sup-1的[BCS 2-Cu（I）] 3+复合物的消光系数计算确切的金属浓度。 cm ^-1（Xiao等人，2011）。考虑所有稀释步骤。
总结供体和受体部分中的总摩尔蛋白和铜浓度，并计算它们的比例以确定离子转移效率。

注意，在重组膜蛋白的情况下，100％的效率是不太可能的，并且在我们的实验中从未达到。这是由于CopA受体蛋白质向脂质相中的各向异性整合以及由此导致的对金属供体蛋白的不可接近性。
对于可溶性蛋白质，可以观察到超过90％的转移效率

代表数据

载铜的MBD2和脂质重建的CopA的分离的典型实例显示在图2中。完整的示例性实验数据，即，蛋白质的浓度（从分光光度计读取的OD <和在转移实验之后的铜（如上所述以比色法测定）显示在参考文献1的图4中。

笔记

避免将GE Superdex分析凝胶过滤柱装入混浊样品。在样品施加之前通过离心（Eppendorf microfuge）除去沉淀
蛋白质和铜的测定是相当可靠的。然而，使用分析凝胶过滤柱，分级后的样品体积限制为足以用于两种组分的单一化学测定。来自单次转移实验的数据通常提供金属转移效率的合理数字。为了正确验证转移结果，来自至少四次色谱分离的实验数据应该是适当的。
在实际交换之前监测供体和受体蛋白质的金属含量是非常重要的对照实验。因此，我们建议单独使用供体或受体蛋白进行凝胶过滤。另外，可以以这种方式检测来自纯化的受体蛋白质中的金属携带，例如，。测量值可以用作"金属含量基线"以计算由共孵育产生的转移金属的净量。

食谱

缓冲区A
30mM MOPS，pH7.5 150mM NaCl
BCA铜缓冲液
缓冲液A与2.5mM BCA
1mM CuSO 4
20mM抗坏血酸盐
SDS溶液
25％SDS（w/v）在H 2 O中在37℃下制备以获得更好的溶解性
抗坏血酸盐溶液
100mM抗坏血酸钠，pH调至7.5 以小等分试样储存在-20℃下
BCS解决方案
10mM BCS，在30mM MOPS，pH7.5中避光

致谢

我们感谢波鸿鲁尔大学的蛋白质研究部的资金支持。

参考文献

Drees，SL，Beyer，DF，Lenders-Lomscher，C.和Lübben，M.（2015）。大肠杆菌中的连续金属结合结构域的不同功能 P1 B -ATPase CopA Mol Microbiol 97 ：423-438。

Fan，B.，Grass，G.，Rensing，C.and Rosen，BP（2001）。大肠杆菌 CopA N-末端Cys（X）（2）Cys基序不需要铜抗性或转运。 Biophysical Research Communications 286：414-418。

Fan，B。和Rosen，BP（2002）。生物化学表征的CopA，大肠杆菌Cu（I）转运P型ATP酶。生物化学杂志277：46987-46992。

Gonzalez-Guerrero，M.，Hong，D. andArgüello，JM（2009）。分子伴侣介导的Cu ⁺递送至Cu ⁺运输ATP酶核苷酸结合的要求。 em> 284：20804-20811。

Gonzalez-Guerrero，M.，Eren，E.，Rawat，S.，Stemmler，TL和Argüello，JM（2008）。如何测量和预测蛋白质的摩尔吸光系数。蛋白质科学 4：2411-2423。

Xiao，ZG，Brose，J.，Schimo，S.，Ackland，SM，La Fontaine，S.and Wedd，AG（2011）。