材料和试剂

24孔板（Nunc）
大鼠幼年P0，海马（图1）
L-15（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：21083）
葡萄糖（Sigma-Aldrich）
庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G1272）
Trypsine（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：150900046）
DNase
富集的富含葡萄糖（0.6％），Glutamax（2mM）和庆大霉素（15μg/ml）（Gibco，目录号：32360-026）的MEM（最低必需培养基）
B-27（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：17504）
马血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：16050）
胎牛血清（Gibco）
5-氟-2-脱氧尿苷（FUDR）（Sigma-Aldrich，目录号：F0503）
Calcein-AM（Sigma-Aldrich）
Zeta抑制肽（ZIP）（AnaSpec）
Scr-ZIP（Anaspec，与ZIP相同的氨基酸，以乱序排序）
碘化丙啶（Sigma-Aldrich）
NaCl（Sigma-Aldrich）
KCl
MgCl 2（Sigma-Aldrich）
CaCl 2（Sigma-Aldrich）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：83264）
标准细胞外介质（参见配方）

图1.啮齿动物脑的3D重建。在绿色 - 双侧海马（由Allen Brain Atlas翻译）

设备

生物罩（Haroshet Ltd.）
37℃/5％CO 2加湿培养箱（Tuttnauer，型号：TUTT2424-2）
共聚焦激光扫描倒置显微镜（Zeiss，型号：LSM 510），具有40x油浸物镜（1.3NA）
标准台式离心机
装有相位光学装置的倒置显微镜（尼康）
解剖双目显微镜

软件

图像J
LSM 510软件

程序

原发性脑培养
1. 将Wistar Rat幼鼠在出生当天断头（P0），取出它们的大脑并放置在冷冻（4℃），充氧（通过用移液管吸头鼓泡）的Leibovitz L15培养基，富含0.6％葡萄糖和庆大霉素（20μg/ml）。除去海马并小心地剥离脑膜。
2. 通过在与胰蛋白酶（0.25％）和DNase（50μg/ml）孵育后在37℃下孵育20分钟，通过研磨机械解离海马组织。
3. 37℃，5％CO 2中。通过离心将组织用2ml的L15培养基洗涤3次，并传递至平板培养基。其由含有5％热灭活的马血清（HS），5％胎牛血清和富含0.6％葡萄糖的B-27（1μl/1ml）的1ml最小必需培养基（MEM，Earl盐），庆大霉素（20μg/ml）和2mM glu??tamax（富集的MEM）。细胞数可以通过在Neurobauer（Boeco，Germany）上计数台盼蓝染色的细胞来测定，或估计，假设每个海马含有大肠杆菌。 1百万细胞。将1ml培养基中的约10 5个细胞接种在24孔板的每个孔中，接种到海马神经胶质饲养层上，所述海马神经胶质饲养层在玻璃上生长2周，然后铺板神经元（ Papa等人，1995，Goldin等人，2001）。
4. 使细胞在湿润的培养箱中在37℃，5％CO 2下生长4天，此时将培养基变为富含MEM中的10％HS，加上5％ - 氟-2-脱氧尿苷/尿苷（FUDR）（分别为20μg和50μg/ml），以阻断胶质增生。 4天后，用不含FUDR的MEM中的1ml 10％HS替换培养基，并且不进行进一步的改变。
  注意：我们常规使用Wistar大鼠，但是该程序应该适用于其他大鼠品系，并且具有小的修饰，也适用于小鼠培养物。该程序在其他大脑区域是类似的，并且新皮质或纹状体已成功使用这种方法。我们没有尝试小脑或脊髓文化。我们使用P0大鼠，这个协议是有用的，直到P4-5，超出活细胞的产量大大减少。
活力测定
1. 将细胞在室温下在标准细胞外培养基中温育，并在具有40x油浸物镜（1.3NA）的Zeiss LSM 510激光扫描共聚焦显微镜的台上成像。
2. 首先将培养物加载到具有2μM钙荧光素-AM的1ml标准记录介质中30分钟，并在PI（2.5μM）存在下在1.8ml标准培养基中成像。每天使用新的ZIP或Scr-ZIP（用作对照的乱序肽），稀释至1mM的终浓度并保持在-4℃，或在起始后5-10分钟加入对照培养基成像。
3. 获得两通道图像[Calcein-AM /碘化丙啶（PI）]，其中绿色（488nm）和红色（545nm）荧光细胞分别代表活细胞和死细胞。
4. 培养物的时间推移成像在室温下以4分钟间隔进行90分钟。每个盖玻片的几个视场被重复成像。生存概率计算为[[no。活细胞（细胞染成绿色）（attime t）/无。活细胞（t = 0）] * 100]。失去其颜色（钙黄绿素-AM泄漏出）或获得红色染色（PI进入细胞）的细胞不被认为是活的（图2）。没有检测到红色和绿色的共染色。神经元可以容易地与神经胶质细胞区分，因为后者组由大的扁平细胞组成，而神经元胞体更紧凑和3维。
5. 标准成像软件（Image J）用于计数每个图像的活细胞数
  
  图2.测量应答ZIP应用的海马培养物的生存力。A.使用钙荧光素-AM（绿色）和碘化丙啶（红色）测定培养的海马神经元的活力。将培养物暴露于不同剂量的ZIP [载体（0μM）/1μM/2μM/5μM/10μM]。比例尺，50μm; B.从以4分钟间隔获取的时间推移图像构建剂量反应曲线（图3），以评估用ZIP处理后的细胞死亡率; C.柱状图总结了培养物存活力的总变化（n = 22盖玻片，3,544个细胞，值是平均值±SEM，在ZIP处理后90分钟对比活力预处理，配对t检验，*** < <0.005）; D.Scr-ZIP诱导培养物生存力的相似变化。条形图总结了培养物存活力的总变化（n = 13盖玻片，2,365个细胞，scr-ZIP-处理后90分钟与存活力预处理，配对t-检验，*** p < 0.005）。（摘自Sadeh等人，2015年）。
  
  图3.海马培养物时间推移成像的图示。细胞加载钙黄绿素-AM并在碘化丙啶存在下成像。在t = 0时向培养物中加入10μMZIP。细胞被认为在细胞计数中存活，只要它保持绿色荧光。

笔记

该方法允许我们区分在药物治疗开始之前已经死亡的细胞（用PI染色但是没有用钙黄绿素-AM早期染色的细胞），在治疗期间和之后死亡的细胞（最初用钙黄绿素-AM染色）和那些幸存的损伤（仅用钙黄绿素AM染色）。
此外，该程序允许基于其不同的形态在神经元和神经胶质之间进行区分。
使用选择性活胶质污渍可以使胶质的其它染色成为可能（Nimmerjahn等人，2004）。
最后，细胞的时间推移成像允许追踪神经元群体中细胞死亡的过程（例如，图3）。

食谱

标准细胞外培养基（过滤并在0-4℃冰箱中储存长达1个月） pH = 7.4,32mOsm
129 mM NaCl 4 mM KCl
1mM MgCl 2
2mM CaCl 2 2 / 10.5 mM葡萄糖 10 mM HEPES

致谢

改编自"Zeta抑制肽，蛋白激酶Mζ的候选抑制剂，对培养海马神经元有兴趣毒性"（Sadeh等人，2015）。

参考文献

Anfarcrona，M.，Dypbukt，JM，Bonfoco，E.，Zhivotovsky，B.，Orrenius，S.，Lipton，SA和Nicotera，P。（1995）。谷氨酸诱导的神经元死亡：依赖于线粒体功能的一系列坏死或凋亡。神经元 15（4）：961-973。
Decker，T.和Lohmann-Matthes，ML（1988）。
Goldin，M.，Segal，M。和Avignone，E。（2001）。功能可塑性触发树突棘在培养的海马网络中的形成和修剪。 J Neurosci 21（1）：186-193。
Ling，DS，Benardo，LS，Serrano，PA，Blace，N.，Kelly，MT，Crary，JF and Sacktor，TC（2002）。蛋白激酶Mzeta对于LTP维持是必要的和充分的。 Nat Neurosci 5（4）：295 -296。
Mosmann，T。（1983）。快速比色法细胞生长和存活：应用于增殖和细胞毒性测定。 Immunol Methods 65（1-2）：55-63。
Papa，M.，Bundman，MC，Greenberger，V.and Segal，M。（1995）。通过LTP的维护机制存储空间信息。 313（5790）：1141-1144 。
Sadeh，N.，Verbitsky，S.，Dudai，Y.和Segal，M.（2015）。 Zeta Inhibitory Peptide，Candidate Inhibitor of Protein Kinase Mizeta，Is Excitotoxic to Cultured Hippocampal Neurons。
Slepian，MJ，Massia，SP和Whitesell，L.（1996）。通过诱导热休克反应预处理平滑肌细胞限制机械损伤后的增殖。生物化学生物物理研究通讯（Biochem Biophys Res Commun）225（2）：600-607。