材料和试剂

培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875713）
玻璃烧瓶（Fisher Scientific，目录号：FB-500-50）
1.5ml离心管（Fisher Scientific，目录号：02-682-550）
15ml锥形离心管（Fisher Scientific，目录号：05-527-90）
50ml锥形离心管（Fisher Scientific，目录号：12-565-270）
应变PCC 7120（以下称为"Anabaena 7120"）
大肠杆菌（大肠杆菌）NEB10β[Δ（ara-leu）7697 araD139 fhuAΔlacX74 galK16 galE15 e14-Φ80< （mrr-hsdRMS-mcrBC dph），其中所述mrr-hsdRMS-mcrBC d lacZ Δm15recA1 relA1 endA1 nupG rpsL（StrR） em>）; New England BioLabs，目录号：C3019H]
E。大肠杆菌HB101 [F ^- mcrB mrr ems hsd S20（r subB ^- m < B6， ara -14， pro em> A2， lac Y1， K2， xyl -5， mtl -1， rps L20（Sm ^R） gln V44λ^-; Promega，目录号：L2015]
结合质粒pRL443和辅助质粒pRL623（Elhai等人，1997）
pZR606，一种用于 anabaena 7120的整合载体（Chen 。，2015）。 pZR606可根据要求提供（GenBank，目录号：KJ500179.1）
pZR670（可根据要求提供），Anabaena中的复制型载体 7120（Xu et al。，205）[提供pZR670的图谱（图S1 ）。]
LB肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3522-1KG）
LB琼脂，用于生长E。大肠杆菌（MP，目录号：100262）
注意：这个品牌的琼脂不适用于蓝细菌。
Agar，生长Anabaena 7120和其他蓝细菌（Fisher Scientific，目录号：A360-500）所需的。
Immobilon-NC转移膜（Millipore，目录号：HATF08550）
氨苄青霉素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A9518-25G）
氯霉素（Fisher Scientific，目录号：BP904-100）
红霉素（Sigma-Aldrich，目录号：E6376-25G）
硫酸卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K4000-25G）
壮观霉素二盐酸盐五水合物（Sigma-Aldrich，目录号：S9007-25G）
MgSO 4·7H 2 O（MP，目录号：194833）
CaCl 2 2·2H 2 O（Fisher Scientific，目录号：BP510-500）
NaCl（Fisher Scientific，目录号：S271-1）
（Fisher Scientific，目录号：BP363-500）
KNO 3（Fisher Scientific，目录号：BP368-500）
NaNO 3（Fisher Scientific，目录号：BP360-500）
MnCl 2·4H 2 O（Fisher Scientific，目录号：M87-100）
Na 2 Mo 4+ 2H 2 O（99％纯度）（Acros Organics，目录号：206371000）
ZnSO 4·7H 2 O（Fisher Scientific，目录号：Z76-500）
CuSO 4·5H 2 O（Fisher Scientific，目录号：BP346-500）
（Fisher Scientific，目录号：BP168-500）
（Acros Organics，目录号：194910500）。
CoCl 2 6H·6H 2 O（Fisher Scientific，目录号：C371-100）
KOH（Fisher Scientific，目录号：P250-500）
Na 2 EDTA·2H 2 O（Fisher Scientific，目录号：BP120-500）
FeSO 4 7HH 2 O（Fisher Scientific，目录号：I146-500）
Allen和Arnon培养基加硝酸盐：AA/8（N）（参见配方）

设备

离心机（Beckman，型号：Allegra X-15R; Thermo Fisher Scientific，Sorvall TM supec TM 型号：Micro17）
将配备有连续荧光照明（约50-100μE/m 2 s/s）（Eppendorf，New Brunswick sup>，型号：44R）
配备有数字温度控制系统和Sylvania荧光灯泡（F40CWX，40W/4100K，T12）的蓝细菌培养室（恒温在30℃）
注意：蓝藻培养室中的浅色架子能够提供连续的光照（约50-150μE/m ²·）。
ESCO层流柜（ESCO，Clean BenchAirstream 型号：AHC-4B2）
水浴超声器（Bransonic超声波清洗机，型号：1510R-MT）
显微镜，奥林巴斯立式复合显微镜（Olympus，型号：AX70; BX53）
PCR热循环仪（Bio-Rad，Touch ^TM，型号：C1000）
UV-Vis分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：GeneSyS 10S）

程序

E的制备。大肠杆菌菌株
1. 扩增来自鱼腥藻染色体DNA的靶基因的内部片段（至少500bp）。
2. 将内部片段克隆到多个克隆位点（ Bg lII- 不是 I- p RR606（Km /Ap I-Sma I/ Xma sup>）以产生货物质粒[参见（Chen等人，2015）中的细节]。提供了pZR606中多克隆位点的图谱（图S2 ）。货物质粒必须转化为大肠杆菌NEB10β或大肠杆菌DH10B。
3. 成长。在含有100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素的2ml LB肉汤中培养含有pRL443（Ap ）和pRL623（Cm R）的大肠杆菌HB101 （?16h），在37℃，200rpm振荡。同时，在具有50μg/ml卡那霉素的2ml LB肉汤中在37℃下以200rpm振荡培养携带货物质粒（Km /Sp R ）的NEB10β过夜。
4. 转移100微升的上述过夜E。大肠杆菌培养物分别加入含有合适抗生素的5ml新鲜LB;继续生长?3小时（OD <600 ）
5. 通过在25℃（室温）下在Allegra X-15R中以4,000×g离心10分钟收获5ml培养物。
6. 用1ml LB洗涤细胞沉淀三次，以完全除去抗生素，然后加入200μlLB分别重新悬浮沉淀。
7. 对于交配实验，100 100 NEB106携带货物质粒与100微升含有pRL443和pRL623的HB101，并在室温下孵育30分钟（实验组）。对于阴性对照，将100μlLB与含有pRL443和pRL623的100μlHB101混合，并在室温下孵育30分钟（对照组）。
准备 7120文化
1. 在30ml AA/8（N）培养基（Allen& Arnon，1955a，Allen& Arnon，1955b）或BG11培养基（Rippka等人）中培养Anabaena 7120。，1979）。 5天直到它达到早期指数期（OD <700）。在30℃下在连续光照（约50μE/m 2 s）下生长并在温度控制的Innova-44R中以120rpm振荡的（New Brunswick Scientific）或在具有连续光照明（约50μE/m 2秒）的蓝藻培养室中，在30℃下以120rpm振荡。
2. 通过在25℃下用Allegra X-15R在4,000×g离心10分钟收获培养物。
3. 用2ml AA/8（N）在25ml玻璃烧瓶中重新悬浮细胞沉淀，通过超声处理培养物60-120秒，使用水浴超声仪图S3 ）。在标准模型下设置超声波仪，并在超声处理过程中向操作水平线添加水
4. 将超声处理的培养物转移到15ml离心管中并在4℃下在Allegra X-15R中在25℃下离心10分钟。用1ml AA/8（N）重悬细胞沉淀，将细胞转移到1.5ml Eppendorf管中，然后在6,000×g离心1分钟（Thermo Fisher Scientific，Micro17）1分钟25℃。用400μlAA/8（N）重悬浮沉淀;然后将细胞平均分成两个管
将货物质粒共轭转化为 7120
1. 混合200μl的 7120重悬浮（步骤11）与200μl的交配的E。大肠杆菌混合物（实验组，步骤7）或对照混合物（对照组，步骤7），并在室温下再温育30分钟。
2. 将共轭混合物铺展到含有5％LB（v/v）的没有抗生素的AA（N）琼脂上的高压灭菌的Immobilon-NC转移膜上，并在30℃下，连续光照（约50μE/2 ？s）培养24小时。
3. 将膜转移到具有10μg/ml壮观霉素（Sp10）的AA（N）琼脂板上，并在相同的生长条件下孵育直至壮观霉素抗性菌落在10-15天内逐渐出现，如图1所示（顶部和中间图）。
  
  图1.潜在敲除突变体的筛选将具有货物质粒的共轭转移混合物涂布在含有Sp10的AA（N）琼脂顶上的Immobilon-NC膜上（< em>）和19天（中间面板）。底部图显示将上述单个菌落重划线到含有用于分离的Sp10的新AA（N）琼脂平板上。作为阴性对照，无货物质粒的共轭转移混合物（对照）在含有Sp10的AA（N）琼脂平板上没有显示单个菌落（数据未显示）。
敲除突变体的验证
1. 将至少10个潜在敲除突变体菌落重新连接到含有Sp10的新鲜AA（N）琼脂平板上，使得突变体染色体完全分离（图1，底部图），因为鱼??腥藻7120具有多个染色体拷贝每个细胞（Hu等人，2007）。
2. 通过菌落PCR筛选阳性敲除突变体菌落。设计三个引物以验证靶基因敲除突变体。使用靶向基因开放阅读框（ORF）引物对[正向引物（FP）和反向引物（RP）]来验证野生型基因;而使用与载体特异性引物ZR90（AAGTTCTTCTCCTTTGCTAGC）（Chen等人，2015）配对的正向引物FP来区分来自WT的阳性敲除突变体。使用标准PCR程序，除了通过在6μlddH 2 O中在95℃下预热蓝细菌细胞悬浮液10分钟来制备染色体DNA模板。
3. 完全悬浮PCR阳性突变体菌落在100微升AA/8（N）培养基，使系列稀释（1x，10x和100x）。然后将每个稀释液重新连接到含有Sp10的AA（N）琼脂平板上用于单菌落以分离E。大麻污染。使用上述菌落PCR再次确认这些单个鱼腥藻敲除突变体菌落。
4. 重复步骤15至17，直到在敲除突变菌落PCR中没有检测到野生型靶基因。图2中显示了 anabaena 7120中 all4160 的灭活突变体的菌落PCR验证的实例。
  
  图2.在鱼腥藻7120中单个交换灭活的 all4160 突变体的菌落PCR验证。目标基因特异性F 4160 使用来自all4160的敲除突变菌落的PCR扩增（泳道2-3和泳道2-3）用于PCR扩增，其中使用+ R sub 4160和F sub 4160 + ZR90引物对5-6）或来自WT 7120（泳道4和7）作为对照。用F 4160+ R 4160和F 4160+ + ZR90引物对扩增的PCR产物大小预期为1,056bp（泳道7）和（泳道2-3）。还显示了DNA梯形（泳道1）的大小。泳道2& 3或泳道5& 6是两个独立的敲除突变体。泳道5&图6显示靶基因被成功敲除，突变体完全分离。 F ₁₄₆₀：ggatccatatgTACATGGCAACCAAAGTG，R ：gtcgacATAAGCGCCACTATTTCTATTAAA（大写字母表示对应于 all4160 的核苷酸）。
互补实验
1. 需要互补实验以证实靶基因而不是下游基因负责突变表型，因为在一些情况下，敲除突变体表型可能是由于对下游基因的表达的极性效应。通过将整个靶基因编码区亚克隆到穿梭载体pZR670（Xu等人，2015）或pRL2833a（Wolk等人，2010）中来测试单个基因的互补，/2007），其含有氯霉素（C max）和红霉素（Em sup R）抗性基因。为了构建互补质粒，将靶基因的编码序列克隆到多克隆位点（MCS）（NsiI/IeI/Nde I/em/I/em/I/em/II/I am/I am/I am I/（图3），与glnA起始密码子符合读框。例如，将alr4853的编码测序框内克隆到经消化的pZR670的Nde I-Xho I中，产生pZR1617 al 。，2015）。
  
  图3.互补载体pZR670的多克隆位点。 p glnA ：glnA的启动子区域（ alr2328 ），RBS：核糖体结合位点，5'-glnA：鱼腥藻GlnA（谷氨酰胺合成酶）的N-末端部分（MTTPQEVLKRI），MCS（以红色突出显示的核苷酸）：多克隆位点。靶基因编码序列（ORF）可以框内插入Nde I I和Avr II/em/Aat II/em之一> Xho I/ Asc I/ Nae I/ BamH I digested pZR670（Xu 。，2015）。
2. 部分C中描述的类似方法用于将互补质粒转移到敲除突变体中。 E。（步骤3至11）制备大肠杆菌和洋葱突变体培养物，除了货物质粒被互补质粒代替。然后用1.5ml离心管中的AA/8（N）稀释突变鱼腥藻培养物5x，10x和100x。将5μl稀释的培养物点样在含有5％不含抗生素的LB的AA（N）琼脂上的Immobilon-NC膜上。每个样品做3个重复点。空气干燥膜几分钟;然后点5μl的交配的E。大肠杆菌混合物在 Anabaena 点上。空气干燥几分钟，并在30℃下在连续光照（约50μE/m 2秒）下孵育该板24小时。
3. 将膜转移到含有Sp10和10μg/ml红霉素的AA（N）琼脂板上，并在相同的生长条件下孵育。 Sp-Em-抗性菌落将在10-15天内生长，类似于图1所示
4. 然后通过用针对Em抗性基因的特异性引物进行菌落PCR验证含有互补质粒的Sp-Em-抗性菌落。
5. 检查至少三个验证的菌落的表型，看看互补质粒是否能够补充单交换产生的突变体。如果互补的突变体显示恢复的野生型表型，其中靶基因已经通过单一交叉方法成功灭活，您可以得出结论，目标基因负责突变体的表型，暗示目标基因的功能。
6. 如果互补质粒未能在步骤22中将突变体表型恢复为其野生型表型，则这表明突变体表型可能由对下游基因的极性效应引起。在这种条件下，尽管其已经成功灭活，但是对于靶基因没有功能线索。

笔记

菌株PCC 7120也可以在BG11培养基中生长（ http://www-cyanosite.bio.purdue.edu/media/table/BG11.html ）（Rippka等人。，1979）。
将膜转移到具有适当抗生素的AA（N）琼脂板上，保持跟踪膜颜色变化。野生型 anabaena 7120应杀死，膜的颜色应逐渐变为黄色。
每周更换适当的抗生素的AA（N）琼脂板，以维持有效的抗生素。如果对照板（含有pRL443和pRL623的Anabaena 7120 + HB101）的膜在一周内没有变成黄色，则立即将所有膜转移到含有合适抗生素的新AA（N）琼脂板上。

食谱

Allen和Arnon培养基加硝酸盐：AA/8（N）
7120在改良的Allen-Arnon培养基（Allen& Arnon，1955a）中生长。 AA液体培养基用无菌蒸馏H 2 O稀释8倍以制备AA/8。为了制备AA/8（N），将最终浓度为2.5mM的硝酸盐加入到来自KNO 3/NaNO 3储备溶液的AA/8培养基中。为了制备AA（N）琼脂平板，将2.5mM硝酸盐和1％琼脂的终浓度加入AA培养基中。
1. AA介质制剂
  解决方案A 25.0 ml
  溶液B 6.25ml
  琼脂（如果需要）10.0克
  蒸馏水969.0 ml
  将200ml分装到五个瓶中，然后在121℃下高压灭菌20分钟
2. 溶液A（A& A减磷酸盐储备溶液）
  4％MgSO 4·7H 2 O 500.00ml（最终浓度1％，m/m）
  1.2％CaCl 2·2H 2 O 500.0ml（终浓度0.3％，m/m）
  3.8％NaCl 500.0ml（终浓度0.95％，m/m）微量元素储备溶液500.0ml（溶液A中微量元素的最终浓度为四倍稀释的微量元素储备溶液）
3. 溶液B（K 2 HPO 4储备溶液）
  HPO 21.40 g
  蒸馏水500.0 ml
4. KNO 3/NaNO 3储备溶液（500mM）
  KNO ₃ 25.276克
  NaNO <3> 21.249克
  加入蒸馏的H 2 O至最终体积为500ml
  将原液高压灭菌并在4℃下贮存
5. 微量元素储液
  A& FeEDTA溶液160.0ml
  MnCl 2 2·4H 2 O 360mg/dm 2 ZnSO 4·7H 2 O 44.0mg
  CuSO 4·5H 2 O 15.8mg
  H sub 3 3 BO 3 572.0mg
  
  CoCl 2 2·6H 2 O 8.0mg/dm 2 蒸馏水1,090.0 ml
6. A& FeEDTA储备溶液
  将5.2g KOH溶解在186ml蒸馏水中，加入20.4g Na 2 EDTA 2·2H 2 O·h / 在364ml蒸馏水中溶解13.7g FeSO 4·7H 2 O。混合以上两种溶液，然后鼓泡微孔过滤的空气通过溶液，直到颜色变化。 FeEDTA溶液的最终pH为约7.5。

致谢

该协议基于出版物"DNA到蓝细菌的共轭转移"（Elhai和Wolk，1988）; "在蓝细菌中的同时基因失活和启动子报告"（Chen等人，2015），和"Characterization of five putative aspartate aminotransferase genes in the N sub 2 -fixing heterocystous cyanobacterium 菌株PCC 7120"（Xu等人，2015）。作者感谢Jaimie Gibbons对于手稿的批判性阅读。这项工作得到NSF，可持续发展能源补助金CBET1133951（R.Z.），以及USDA-NIFA补助金11665597（R.Z.）的部分支持。

参考文献

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