材料和试剂

1.5ml离心管
1-200μl体积移液器吸头
叶组织（Okanagan薰衣草和草本农场和绿地花园中心，基隆拿，加拿大BC）
DNA序列（表达序列标签）（EST）
液体N <2>（Praxair）
基因组DNA迷你试剂盒（Plant）GP100（Geneaid Biotech Ltd.，目录号：GP100）
10×PCR缓冲液（NEB，目录号：M0320S）
Taq聚合酶（NEB，目录号：M0320S）
dNTP（Omega Bio-Tek，目录号：TQAC135）
MgCl 2溶液（NEB，目录号：M0320S）
牛血清白蛋白（BSA）（NEB，目录号：B9000S）
定制合成的引物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM）
SYBR 安全DNA凝胶染色（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：S33102）
10×DNA加载染料（Ward's Science，目录号：389115）
丙烯酰胺40％溶液（丙烯酰胺：双丙烯酰胺19:1）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP1406-1）
50bp DNA梯（NEB，目录号：N3236S）
1kb DNA梯（FroggaBio，目录号：DM010-R500）
无核酸酶水（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP5611）
过硫酸铵（APS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP179-100）
NNN'N'-四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T9281）
Tris Base（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP152-1）
冰乙酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：351272-212）
Na 2 EDTA（VWR International，目录号：CA71007-124）
硼酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：B168-1）
PCR反应混合物（参见配方）
0.5 M EDTA（见配方）
50x TAE缓冲区（请参阅配方）
1x TAE缓冲区（请参阅配方）
5x TBE缓冲区（参见配方）
0.5x TBE工作解决方案（参见配方）
10％过硫酸铵（APS）（v/w）（参见配方）
1 M Tris（见配方）
10mM Tris缓冲液，pH8.0（见Recipes）
1％琼脂糖凝胶（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP160-500）（参见Recipes）
6％聚丙烯酰胺凝胶（见配方）

设备

台式机（Dell，型号：Precision T3610塔式工作站）
砂浆和粉彩（VWR国际，瓷器）
Balance（Shimadzu Corporation，型号：ELB300）
冷冻器（-20℃）（Frigidaire，型号：FFFH20F2QW）
热循环仪（Thermo Fisher Scientific，ABI Applied Biosystem公司，型号：Veriti 96孔热循环仪）
水平凝胶电泳（Thermo Fisher Scientific，Owl ^TM EasyCast ^TM，型号：B2 Mini）
垂直凝胶电泳（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-protein Tetra系统）
微量离心机（Eppendorf，型号：5417C）
微波炉（Danby Designer）
水浴（Thermo Fisher Scientific，Isotemp TM数字控制，型号：210）
Gel Imager（Mandel Scientific，型号：Kodak Gel Logic 440）
Sterilmatic高压灭菌器（Thomas Scientific，型号：STME-L）
分光光度计（Thermo Scientific，NanoDrop ，型号：2000）

软件

BatchPrimer 3（ http://probes.pw .usda.gov/cgi-bin/batchprimer3/batchprimer3.cgi ）（您等。，2008）
SSR挖掘服务器（ https ：//www.rosaceae.org/bio/content？title =& url =/cgi-bin/gdr/gdr_ssr ）（Jung等人，2008） >
Perl脚本MIcroSAtelitte（MISA）识别工具（ http：//pgrc.ipk- gatersleben.de/misa/）
注意：可选软件，但我们的研究中未使用
Blast2go在线平台（ https://www.blast2go.com/）（Conesa et al 。，2005）
OligoAnalyzer 3.1（ https://www.idtdna.com/calc/analyzer）

程序

薰衣草EST文库的SSR鉴定
1. 为 L开发了包含大约23,000个序列的表达序列标签（EST）数据库。 angustifolia 和 L。 x intermedia 植物（Lane ，2010; Demissie等人，2012）。 EST文库开发的主要步骤包括总RNA分离，mRNA纯化和cDNA文库构建，以及通过Sanger测序在5'端随机cDNA克隆的部分测序。
2. 基于两种物种的来源EST手工分选EST文库。 angustifolia 和 L。 x intermedia ，并且用于使用基于网络的SSR分析工具的简单序列重复（SSR）鉴定（Jung等人，2008; You 。，2008）（图1）。
3. 在FASTA格式中排序的ESTs在BatchPrimer3软件中进一步手动分解成多个文件，最大输入序列为500个EST（You 等。，2008）。对于每个输入文件，设置SSR筛选参数以挑选具有对于二，三和四核苷酸为12bp，对于五核苷酸为15bp以及对于六核苷酸为18b的最小长度的引物对和SSR基序，核苷酸。然后，对引物长度（18,21和25bp），产物大小（120,200和300bp），GC含量（40,50和60％），Tm （50,55和60℃）。最后，运行SSR与来自输入序列的引物组的筛选，并且输出以HTML格式显示并保存为制表符分隔的文本或excel文件，用于进一步分析SSR重复。
4. 将排序的EST文件直接导入蔷薇科（GDR）SSR挖掘服务器的基因组数据库（Jung等人，2008），并设置最小SSR基序筛选参数对于单核苷酸和五核苷酸为15bp，对于二，三和四核苷酸为12bp，以及对于六核苷酸为18bp。其他引物生成参数保留为软件的默认参数。然后将输出生成为制表符分隔的文本文件格式，这些文件格式很容易转换为excel文件以进行进一步的SSR重复分析。 [可选：可以使用Perl脚本MIcroSAtelitte（MISA）识别工具进行自动SSR识别和潜在引物设计。]
5. 使用上述工具基于在SSR基序识别期间设计的引物进一步过滤出具有潜在引物侧翼区的SSR。
6. 所有鉴定的具有引物侧翼区域的SSR再次表征，将重复序列的长度作为更长类型，SSR长度对于三核苷酸≥18bp，对于二，四，五和六核苷酸≥20bp，比那些划分为较短类别。
7. 为了预测更长类别下的重复的推定的功能作用，使用Blast2GO在线平台（Conesa等人，2005）对包含具有引物侧翼区的SSR的EST/unigenes进行公开数据库注释。简而言之，包含≥18bp重复序列的ESTs被过滤并上传到Blast2GO中，然后针对公共数据库进行爆破。然后，在最后推定的功能注释之前继续具有Blast命中的EST的映射。最后，基于检测到的注释，基因神经（GO）注释的特征和SSR含有EST的推定功能。
8. 根据所标注的功能或鉴定的重复的随机表示，选择unigenes/EST，并用于手动精制设计的引物对，随后相应地最小，最佳和最大参数：引物长度（18,21和25bp），产物大小120,200和300bp），GC含量（40,50和60％），Tm（50,55和60℃）和其它使用OligoAnalyzer 3.1在线软件。（可选：底漆设计可以通过任何底漆设计工具完成。）
  
  图1.来自薰衣草物种的EST文库的SSR分析概述以及来源和相关的薰衣草属物种上鉴定的SSR的验证。来自ESTs和随后的SSR分析的主要步骤验证包括：（1）EST文库开发; （2）使用基于网络的挖掘工具的SSR基序识别; （3）SSR表征，引物设计和引物的定制合成; （4）基因组DNA分离; （5）预期的含有SSR基序的片段的PCR扩增;和（6）解析聚丙烯酰胺凝胶上的DNA片段，用于将扩增子打分为存在（1）或不存在（0）。
验证和评估SSRs的物种间转移性
1. 从上述程序中选择的引物组是定制合成的并且重悬于10mM Tris（pH 8.0）缓冲液中并储存在-20℃直至使用。
2. 将来源和相关物种（图1和2）的每个样品的新鲜嫩叶（?100mg）用液体N 2用研钵和杵研磨成细粉，并转移到1.5ml离心机管含有来自植物基因组DNA提取试剂盒的450μl细胞裂解缓冲液（GP1或GPX1）和RNA酶A（5μl）。注意GPX1用于成熟叶组织样品（图2B），主要富含酚类化合物。然后将样品在60℃水浴中孵育10-15分钟，每5分钟反转混合。其余程序根据试剂盒的说明手册进行。最后，在室温下3-5分钟温育后，用总共40μl洗脱缓冲液洗脱每个样品，两次圆形洗脱（分别为25μl和15μl）。使用NanoDrop 2000分光光度计（每个样品1μl洗脱缓冲液作空白和1μlgDNA）定量洗脱的基因组DNA（gDNA）。为了检查gDNA完整性，将10μl与1μl10x负载染料和高压灭菌水混合的gDNA（100-300ng）加载到琼脂糖凝胶（1％）的每个孔中，并用1x TAE的水平凝胶电泳缓冲液在80V下30-45分钟（图3）。 DNA图像然后可视化并由凝胶成像仪（图3）。最后，将每个样品的工作溶液制备成50-70ng /μl，并在-20℃下储存，直到使用
  
  图2. x intermedia cv Grosso植物进行基因组DNA提取。 A.幼苗。 B.成熟植物
  
  图3.从L的幼叶组织分离的基因组DNA样品（200ng /孔）的琼脂糖凝胶（1％）分离。 x intermedia （lane 1-5）和 L。 angustifolia （泳道6-12）植物。 M，1kb DNA梯（300ng）。
3. 使用两阶段扩增程序通过接触式PCR（touch-down PCR）进行每个引物组的PCR扩增（图1）。对于第一阶段，将热循环仪设置为在95℃变性15分钟，随后是11个循环：在95℃变性30秒，在64-54或62-52℃退火30秒（取决于引物类型）在每个退火循环中降低1℃，在72℃延伸2分钟。对于第二阶段，将热循环仪编程为在95℃30秒，54℃或52℃30秒和72℃2分钟进行24个循环，并且通过在72℃最终延伸完成10分钟。
4. PCR扩增产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上分离（图4）。使用标准的1-200μl体积移液管吸头将与加载染料（9μlPCR产物和1μl10x加样染料）充分混合的样品加载到凝胶孔中。一个孔留空以装载含有0.35μl50bp DNA梯（1μg/μl），1μl10×装载染料和8.65μl高压灭菌水的DNA梯状混合物。一旦所有样品和DNA梯度被小心加载，凝胶在使用0.5x TBE缓冲液在160V下进行垂直凝胶电泳约45分钟。
5. 然后将凝胶小心地转移到具有50ml 0.5×TBE缓冲液的塑料容器中，所述缓冲液补充有1μlSYBR safe并摇动30分钟。用新鲜的0.5×TBE缓冲液快速冲洗染色的凝胶后，使用凝胶成像仪拍摄凝胶图像（图4）。
6. 来自L的SSR引物。 angustifolia 或 L。 x中间体EST是在供体物种（与源物种相同）以及跨物种可转移性与其他相关物种之间的多态性验证的。（任选：每个靶向重复序列的单个扩增子可进一步被凝胶纯化和测序，以验证扩增期望片段的设计引物组的真实性。）
7. 由于Lavandula基因组的复杂的多倍体性质，我们基于存在或不存在扩增的SSR片段来评估多态性和跨物种扩增。如果检测到具有期望大小的目标片段，则将数据记录为"存在"（1）。然而，如果靶片段不满足预期大小或没有扩增，则将其记录为该特定片段的"不存在"（0）。作为演示，评估跨越给定样品的强LAF15扩增子（图4）。检测来自两个物种的五个片段（?145,155,185,200,250bp）并记分。对15个样品中的每个片段进行评分，对于检测的片段为"1"，对于无或微弱的扩增为"0"。对于"?145bp"和"?155bp"，从样品-1到样品-15的记分的模式分别是"100100001110100"和"111111111111111"。剩余的三个片段（?185,200,250bp）分别记为"1000000000100100"，"000100001100000"和"101000000000000"。这些评分数据可以根据后续分析软件的格式在Excel表中管理。类似的评分模式也用于相关物种的样品。（任选：荧光染料标记的引物可以定制合成并用于自动毛细管电泳检测，在荧光染料标记的引物扩增过程中用荧光染料标记片段，该选项也可用于检测每个引物组的扩增子的确切数目和大小。）
  
  图4.来自（A）L的样品的EST-SSR（LAF15）扩增子的聚丙烯酰胺凝胶（6％）分辨率。 angustifolia （1-9道）和。（泳道10-15）植物和来自（B）相关物种的样品，包括L。 angustifolia （泳道1）和。 ×intermedia （泳道3）。 M，50bp DNA梯;泳道2，L。 latifolia ;泳道4，L。 buchii ;第5道。 dentata ;第6道。 lusitanica ;泳道7，L。 x ginginsii ;泳道8，L。 stoechas 。

笔记

成熟的叶组织可以含有大量的酚类化合物，其可以与基因组DNA共纯化，并干扰随后的PCR扩增反应。因此，必须特别注意选择用于DNA提取的组织。年轻和新鲜的叶组织（图2A）通常给出比成熟和干燥组织更好的DNA。

食谱

PCR反应混合物，25μl
0.3μM正向引物
0.3μM反向引物
70 ng基因组DNA模板
2.5μl10x PCR缓冲液
1.5mM MgCl 2·h/v 0.5μgBSA
250μMdNTPs
1.25 U Taq聚合酶
无核酸酶水溶液
0.5 M EDTA（pH 8.0）
在400ml RO水中加入93.05g Na 2 EDTA 充分搅拌并用沉淀NaOH调节pH8.0（当pH达到8.0时溶液变得透明）用RO水将体积调至0.5 L / 高压灭菌并在RT储存
50x TAE缓冲液，0.5μL
121克Tris碱（MW = 121.1克/摩尔） 28.5ml冰醋酸
50ml 0.5M EDTA（pH8.0）

轻轻搅拌下将121g Tris溶于300ml无菌反渗透（RO）水中
加入EDTA和冰醋酸
用无菌RO水将终体积调至0.5 L
正确标记并在121℃高压灭菌30分钟
在RT存储

1x TAE缓冲液，4μL

测量80 ml 50x TAE
用RO水
使最终体积为4 L
在RT存储

5x TBE缓冲液，1L，pH 8.3 54克Tris碱（MW = 121.1克/摩尔） 27.5g硼酸（MW = 61.83g/mol） 20ml 0.5M EDTA（pH8.0）

在温和搅拌下将Tris碱溶解在600ml RO水中
加入硼酸
加入EDTA溶液
将pH调节至8.3，并将最终体积调至1 L
在121℃下高压灭菌30分钟并在室温下贮存

0.5x TBE工作溶液，2 L

测量200 ml 5x TBE
用RO水
使最终体积为2 L
在RT存储

10％过硫酸铵（APS）（v/w）
将1g APS（MW = 228.2g/mol）溶解在10ml无菌RO水中
储存于4°C（30天后新鲜制备）
1M Tris（pH 8.0），0.5L
1. 将60.55g Tris碱溶解在400ml
  中
2. 加入20ml浓HCl
3. 用RO水使最终体积为0.5 L
在121℃下高压灭菌30分钟并在室温下贮存
10mM Tris（pH8.0）缓冲液，100ml
取2 ml 1M Tris（pH 8.0）
用灭菌RO水将最终体积调至100 ml 存储在4°C
1％琼脂糖凝胶将0.5g琼脂糖加入含有50ml 1x TAE缓冲液的250ml锥形瓶中在微波炉煮沸，频繁监测，直到它清除
冷却至?50°C
加入1μlSYBR安全，轻轻混匀
倒入凝胶中凝固
6％聚丙烯酰胺凝胶，1.5mm凝胶（10ml）顺序添加：
1. 5.73 RO水
2. 1.67ml丙烯酰胺40％溶液[丙烯酰胺和双丙烯酰胺（19:1）]
3. 2.4 ml 5x TBE缓冲液
4. 200μl10％APS
5. 10μlTEMED
充分混合并用牧草吸管注入凝胶（避免气泡！）
等待完全聚合

致谢

此协议改编自以前发表的研究，Adal等人。（2015）。这项工作是通过UBC，不列颠哥伦比亚省基因组，加拿大自然科学和工程研究理事会，加拿大农业和农业食品部和农业部的补助和/或对SSM的实物捐助（通过投资提供的计划BC省农业基金会）。

参考文献

Adal，AM，Demissie，ZA and Mahmoud，SS（2015）。新颖的Lavandula EST-SSR的鉴定，验证和种间转移性。 Planta 241（4）：987-1004。

Conesa，A.，Gotz，S.，Garcia-Gomez，JM，Terol，J.，Talon，M.and Robles，M.（2005）。 Blast2GO：用于在功能基因组学研究中进行注释，可视化和分析的通用工具。生物信息学 21（18）：3674-3676。

Demissie，ZA，Cella，MA，Sarker，LS，Thompson，TJ，Rheault，MR和Mahmoud，SS（2012）。来自Lavandula的1,8-桉树脑合成酶的克隆，功能表征和基因组组织/em> 79（4-5）：393-411。

Jung，S.，Staton，M.，Lee，T.，Blenda，A.，Svancara，R.，Abbott，A.and Main，D.（2008）。 GDR（蔷薇科基因组数据库）：蔷薇科基因组学和遗传学数据的综合网络数据库。 em> Nucleic Acids Res 36（数据库问题）：D1034-1040

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