材料和试剂

50ml锥形离心管（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-200251）
培养皿，100×15mm（Fisher Scientific，目录号：FB0875712）
15ml锥形离心管（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-200250）
1.5ml微量离心管（USA Scientific，目录号：1615-5510）
重力色谱柱（Thermo Fisher Scientific，Pierce ^{TM，目录号：29920）}
巴斯德吸管（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-204537）
96孔板，平底，黑色聚苯乙烯（Corning，Costar ^TM，目录号：3915）
C57BL/6小鼠（Charles River Laboratories，目录号：027）
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4（137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na 2 HPO 4，2mM KH 2， > PO 4）（Fisher Scientific，目录号：BP24384）
海藻糖（Sigma-Aldrich，目录号：1673715）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：SO389）
[4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙烷磺酸] -KOH（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：H0527）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
乙二醇四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
牛血清白蛋白馏分V（Sigma-Aldrich，目录号：A9418）
蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Fisher Scientific，HALT ^TM，目录号：78430）
Sepharose CL-2B树脂（Sigma-Aldrich，目录号：CL2B300）
5,5'6,6'-四氯-1,1'，3,3'-四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物（JC-1）（Thermo Fisher Scientific，目录号：T3168）
Triton X-100（Fisher Scientific，目录号：BP151-500）
羰基氰4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）（Sigma-Aldrich，目录号：C2920）
重组BAX [使用IMPACT（具有亲和壳多糖结合标签的Intein Mediated Purification）系统（New England Biolabs，目录号：E6901S）纯化]
β-辛基葡糖苷（OG）（Sigma-Aldrich，目录号：O8001）
二甲基亚砜（DMSO）（Fisher Scientific，目录号：BP231-100）
六水合氯化镁（Fisher Scientific，目录号：M33-500）
海藻糖分离缓冲液（TIB）（参见配方）
JC-1加载缓冲区（参见配方）
脂质体缓冲液（参见配方）

设备

解剖工具（剪刀，解剖刀，镊子）
剃刀刀片（Daigger Scientific，目录号：EF7281A）
15ml Potter-Elvehjem dounce匀浆器（Omni International，目录号：07-358044）
回转桶离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM Sorvall ^TM，型号：Legend XTR）
分光光度计（Fisher Scientific，GE Healthcare Ultrospec ^{TM，型号：Ultrospec 7000）}
水浴（Fisher Scientific，IsoTemp TM，型号：215）
台式离心机（Thermo Fisher Scientific，Sorvall Legend ^TM，型号：Micro 21）
荧光平板读数器（Biotek，型号：Synergy H1）

程序

肝线粒体隔离
动物处理，安乐死和解剖必须根据机构动物护理和使用委员会指南进行。我们已经成功地利用二氧化碳窒息在颈椎脱臼之前使小鼠安乐死。但是，我们建议读者咨询并遵守其自己的研究所的动物护理和使用指南以进行适当的操作。以下涉及动物处理和解剖的步骤用手套进行
1. 可视化肝脏，胆管和胆囊。胆管和胆囊必须被去除或保持与肝脏分开，以避免线粒体被胆汁污染（图1a-c）。
2. 切除四个肝叶，立即转移到含有冰冷PBS的50ml锥形管中。在血液污染的情况下，将肝浸泡在冰冷的PBS中，直到没有更多的血液被洗出（图1d-e）。
  注意：从这一点来说，所有的步骤都必须使用试剂和材料在4℃下进行，以尽量减少蛋白酶和磷脂酶的活化。
  
  图1.鼠标解剖
3. 用镊子转移肝脏到一个干净的培养皿放在冰上，排出多余的PBS
4. 使用干净的剃刀刀片将肝脏切碎，直到形成均匀的糊状物（图2）
5. 使用剃须刀刀片将一半肝膏转移到含有10ml TIB的冷却的Potter-Elvehjem dounce匀浆器中。
6. 将杵插入均质器，轻轻向下推。早期阻力在第一次冲击期间是常见的，并且不应向肝膏施加过大的力。相反，将杵向上移动以重新悬浮肝脏膏，并缓慢地重复这些步骤，直到所有的材料能够通过杵没有强烈的阻力。均匀化步骤可以在台架上进行，只要整个程序足够快地进行以保持温度接近4℃即可。
7. 将糊状物均匀化5次，倒入15ml锥形管中并储存在冰上，直到所有肝脏糊状物被处理（图2）。
8. 重复步骤6-8与肝脏的后半部分粘贴。
9. 需要以下差速离心步骤来获得线粒体级分。所有步骤应在4℃的摇桶式离心机中进行。通过使用P1000移液管吸移轻轻地重悬沉淀物（图2）
10. 为了定量重悬沉淀物中分离的物质的量（步骤A9e），将5μl重悬浮的沉淀物加入到995μlTIB（1:200稀释）中，并用分光光度计测量OD520。用TIB稀释线粒体以将样品标准化至OD520值为0.25（?20μg/μl蛋白质）。
11. 此时，可以将分离的线粒体等分（50μl），在干冰 - 乙醇中冷冻以防止形成水晶，并储存在-80℃。
  注意：来自前一步骤的新鲜分离的线粒体应该保持在冰上并在2小时内使用以确保外膜的完整性。如果使用冷冻线粒体，在30℃水浴中解冻样品，并在后续程序中继续使用TIB。
  
  图2.肝线粒体隔离
线粒体标记用JC-1和大小分级
用JC-1标记线粒体，JC-1是在MOMP期间膜电位增加时改变颜色的电位依赖性线粒体染料，允许标准化线粒体级分并实时记录MOMP（例如，参见Renault等人，，2015，图4F）。标记和分馏步骤提供了通过尺寸选择线粒体的机会：大线粒体将在较小的线粒体之前被洗脱。该分馏步骤是任选的，并且需要使用已知尺寸的脂质体作为标准校准柱。另一个选择是使用例如动态光散射来确定每个分数中的平均线粒体大小。如果不希望按大小分级，则可以在步骤B8中组合所有含线粒体的级分。
1. 在250μlTIB缓冲液中稀释50μl线粒体
2. 将JC-1（200μM）加入稀释的线粒体中至终浓度为15μM，并在30℃下孵育10分钟（图3）。
  
  图3.线粒体标记和大小分离
3. 为了除去未结合的JC-1，在室温下将线粒体以5,550×g离心10分钟，并将沉淀重悬于25μlTIB中。
4. 使用重力使2ml CL-2B重力柱与2个柱体积的TIB（4ml）预平衡以使TIB流过CL-2B树脂，将重悬的JC-1线粒体装载到柱上，并允许样品流过。
  注意：确保树脂在装入JC-1标记的线粒体前不会变干。
5. 使用干净的巴斯德吸管缓慢地将4个柱体积的TIB（4×2ml）施加到柱上，并在微量离心管中收集20×100μl（?2-3滴）级分。
6. 为了确定哪些级分含有标记的线粒体，用95μl的0.1％Triton X-100水溶液（0.1％Triton X-100透化线粒体）预填充96孔板，并将每个级分的5μl样品加入到单独的孔。
7. 使用分光光度计（Ex：561nm/Em：620nm）测量荧光以鉴定含线粒体的级分（典型值为大线粒体的10,000-50,000相对荧光单位，对于小尺寸线粒体大于500RFU） br />
8. 合并含有JC-1标记的线粒体的所需级分，并使用相对JC-1荧光强度标准化样品（确定如步骤B6-7中所述的每个组合样品的荧光，并用TIB缓冲液稀释最浓缩的样品以达到最低样本）。
  注意：根据我们的经验，将0.05-1μm脂质体置于CL-2B重力柱上，并用作选择合适级分的参考。简言之，根据Asciolla等人，2012制备几种尺寸（0.05,0.2和1μm）的荧光脂质体。将脂质体加载到CL-2B重力柱上，并收集100μl级分，如步骤B4 -6。鉴定每个脂质体大小的含有脂质体的级分允许确定应该预期在哪个级分中具有给定大小的泡囊。
实时MOMP测量
实时MOMP定量通过使用荧光JC-1染料测量线粒体膜电位（ΔΨM）来确定。 JC-1染料显示出线粒体中的电位依赖性积聚，由从绿色（?529nm）到红色（?590nm）的荧光发射移动指示。 MOMP和随后的ΔΨM的损失由红/绿荧光强度比的降低指示。有大量的选项，以实时调查MOMP的诱导物和调节器的子集。有内部和实验控制是重要的。在表1中给出了一个实例。对于阳性内部对照，我们使用FCCP，其将线粒体中的氧化磷酸化的电子传递解耦并完全去极化线粒体膜。
为了产生阳性实验对照，我们使用洗涤剂活化的重组BAX（Hsu和Youle，1997）。洗涤剂β-辛基葡糖苷（OG）人为引发BAX活化，因此BAX sup OG（20-50nM）可用作可靠的阳性对照（对于100μl的2.3μMBAX ^{OG：在脂质体缓冲液中的5μgBAX + 0.7％OG，在4℃孵育60分钟，等分并保存在-80℃）。
实时测量在TIB中制备2x蛋白/诱导剂溶液，并在96孔板中的每个孔中分配50μl。板应包含以下内部和实验控制（图4;表1）阴性内部控制：仅TIB

阳性内部对照：FCCP（10μM终浓度）

阴性实验对照：纯化的重组BAX（最终浓度为20-50nM）

阳性实验对照：β-辛基葡糖苷 - 活化的BAX（BAX OG ，最终浓度为20-50nM）

图4.实时MOMP

准备一个2x悬浮的JC-1负载线粒体（?2.5 RFU /μl），并添加50μl到每个孔，以达到1.25 RFU /μl的最终浓度。
注意：每个反应?50-100个RFU是理想的。

在平板读数器中在37℃下每5分钟测量荧光60分钟（Ex：561nm/Em：620nm）。

使用以下公式计算已经历MOMP的线粒体的百分比：
％MOMP =（RFU _buffer - RFU _sample）/（RFU _buffer - RFU sub FCCP ）
其中RFU _{buffer和RFU _FCCP分别代表阴性和阳性内部对照的荧光，RFU 样品图4G-H作为例子在雷诺等人。，2015年）。

表1.使用内部和实验控件实时测量MOMP的示例}}

食谱

海藻糖分离缓冲液（TIB）
200mM海藻糖 68mM蔗糖 10mM HEPES-KOH，pH7.4 10 mM KCl
1mM EDTA
1 mM EGTA
0.1％BSA
蛋白酶抑制剂混合物（根据制造商的说明新鲜加入）
注意：应使用BSA-Fraction V制备TIB以消除促进非特异性BAK/BAX激活的脂肪酸和脂质污染物。
JC-1加载缓冲区
在二甲基亚砜（DMSO）中制备200μM储备溶液，并相应地在TIB中稀释
脂质体缓冲液
0.2 mM EDTA
10mM HEPES-KOH，pH7.4 200 mM KCl
5mM MgCl 2/

致谢

我们要感谢Chipuk实验室的所有人的帮助和支持。这项工作由以下支持：NIH授予CA157740和CA206005（到J.E.Chipuk。一个来自NIH P20AA017067（JE Chipuk），JJR基金会（JE Chipuk），William A.Spivak基金（JE Chipuk），Fridolin慈善基金会（JE Chipuk）和美国癌症学会研究学者奖（JE Chipuk）。这项工作还得到了3月的Dime基金会（JE Chipuk），白血病和淋巴瘤学者奖（JE Chipuk）的两项研究资助（5 - FY11-74和1 - FY13-416），以及西奈山肿瘤科学系的发展研究试点项目（JE Chipuk）。

参考文献

Asciolla，JJ，Renault，TT和Chipuk，JE（2012）。检查具有大单层囊泡的BCL-2家族功能。（68）。

Hsu，YT和Youle，RJ（1997）。非离子洗涤剂在Bcl-2家族的成员之间诱导二聚化。 J Biol Chem 272（21）：13829-13834。

Renault，TT，Floros，KV and Chipuk，JE（2013）。使用分离的线粒体的BAK/BAX激活和细胞色素c释放测定。 61（2）：146-155。

Renault，TT，Floros，KV，Elkholi，R.，Corrigan，KA，Kushnareva，Y。，Wieder，SY，Lindtner，C.，Serasinghe，MN，Asciolla，JJ，Buettner，C.，Newmeyer，DDand Chipuk， JE（2015）。线粒体形状控制BAX诱导的膜透化和细胞凋亡。 Mol Cell 57（1）：69-82