材料和试剂

96孔培养板（Sigma-Aldrich，Corning ，目录号：CLS3595）。
人骨髓来源的MSC，如先前所述分离和培养（Kern等人，2006）
注意：使用第三次传代的细胞。
层粘连蛋白511和521（Biolamina，目录号：LN511; LN521）
DMEM（Thermo Fisher Scienfitic，Invitrogen ^TM，目录号：11965092）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scienfitic，Invitrogen ^TM，目录号：10099141）
胰蛋白酶（Thermo Fisher Scienfitic，Invitrogen ^TM，目录号：25200-056）
大豆胰蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scienfitic，Invitrogen ^{TM，目录号：17075-029）}
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：V900933）
封闭缓冲液（不含Ca 2+和Mg 2+的PBS中的0.5％BSA）
洗涤缓冲液（不含Ca 2+和Mg 2+的PBS中的0.1％BSA）
2％SDS（Sigma-Aldrich，目录号：71729）
4％多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：746436）
Na 2 HPO 4（Sigma-Aldrich，目录号：795410）。
KH sub 2 PO 4（Sigma-Aldrich，目录号：P0662）
CaCl 2·2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：223506）
MgCl 2·6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M9272）
HCl（Sinopharm chemical reagent Being Co.ltd，目录号：10011008）
结晶紫色粉末（Sigma-Aldrich，目录号：C6158）
乙醇（Sinopharm chemical reagent Being Co.ltd，目录号：10009159）
具有/不具有Ca 2+ 2 + 和Mg 2+ 2 + 的PBS PBS（参见配方）
注意：也可以使用含/不含钙和镁的商品DPBS。
0.1％结晶紫染色溶液（见配方）

设备

用于微量滴定板（IKA，型号：MS3Digital）的小振荡器
扫描仪（UMAX，型号：POWERLOOK 2100XL）
系列II 3110水夹套CO 2室（Thermo Fisher Scientific，Forma ^TM，目录号：3111）
显微镜（Nikon，型号：ECLIPSE TE2000-S）
微孔板读数器（ThermoFisher Scientific，型号：Multiscan MK3）或具有550nm波长的光谱仪

程序

用层粘连蛋白包被板
1. 在使用前，将重组体层粘连蛋白在2°C至8°C缓慢解冻
2. 用1×DPBS（Ca 2+ 2 + /Mg ^{2 +}）稀释解冻的层粘连蛋白储备溶液至10μg/ml，向96孔的每个孔中加入60μl稀释的层粘连蛋白溶液培养板（最终涂层浓度为2μg/cm 2）。确保层粘连蛋白溶液均匀地铺展在整个表面上。将一些孔未涂布为阴性对照。
3. 在2°C至8°C孵育过夜
4. 用洗涤缓冲液（200μl/孔）洗涤2次。
5. 在37℃下在CO 2室中用封闭缓冲液（200μl/孔）封闭板60分钟。
6. 用洗涤缓冲液（200μl/孔）洗涤2次。
注意：所有洗涤程序不需要一些时间孵育，以下是相同的。
准备和种子细胞

以10cm培养皿为例，用2ml PBS洗涤细胞
用2ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA分离细胞，用2ml 0.25mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶。
通过用1ml移液管上下吹吸混合细胞，然后将其转移到15ml无菌管中，并以300xg离心5分钟。
将细胞重悬在含有0.5％FBS的2ml DMEM中
计数细胞并稀释至2×10 5个/ml的终浓度，向每个孔中加入100μl（2×10 4个细胞）。对每种条件设置至少三次重复的孔。
注意：细胞数量根据包被的ECM而不同，对于层粘连蛋白，2×10 ⁴是适当的。但是，非涂层孔可能需要4 x 10 ⁵个细胞。
在37℃（在CO 2室中）孵育20分钟。
注意：粘附时间取决于涂层的ECM。在不同的时间点观察显微镜下的粘附条件是有用的，在5分钟至30分钟（5,10,15,20,30）之间选择，甚至首先进行时间进程。在我们的系统中，细胞在至少10分钟内粘附于层粘连蛋白包被的孔，而对于未包被的孔，可能需要更长的时间。

停止测试

小心弃去播种介质，不要划伤井底。
每孔用200μlPBS冲洗细胞一次。
在2000 rpm下摇动平板15秒。
弃去PBS，并用200μl洗涤缓冲液每孔洗涤3次。
固定与200微升4％多聚甲醛每孔。在室温下孵育10-15分钟。
每孔用200μlPBS洗涤。

染色和分析

向每个孔中加入100μl0.1％结晶紫，并在室温下孵育10分钟。
除去结晶紫，并用ddH 2 O（200μl/孔）洗涤3次。
在吸水纸上翻转平板。让板块完全干燥。
可以首先用扫描仪扫描板
向每个孔中加入100μl2％SDS，并在室温下轻轻摇动孵育10分钟
在微板读数器/光谱仪上在550nm的波长下在5分钟内读取吸光度。

代表数据

图1.层粘连蛋白511促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的粘附。 A.BMSC的结晶紫染色的扫描图像粘附在层粘连蛋白511和BSA包被的孔上; B. O.D. （A）显示来自溶解晶体的值，数据表示为来自三个重复孔的平均值±SEM; ***， P 0.001。

食谱

具有/不具有Ca 2+和Mg 2+的PBS的PBS（参考文献1）
1. 将以下物质溶于800ml蒸馏H 2 O中 8克NaCl
  0.2 g KCl
  1.44g Na sub 2 HPO ₄
  0.24 g KH <2> PO ₄
  对于含Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +}的PBS，请补充以下
  0.133克CaCl 2 2·2H 2 O
  0.10g MgCl 2·6H 2 O·dm /
2. 用HCl
  调节pH至7.4
3. 用额外的蒸馏H 2 O 2调节体积至1L
4. 高压灭菌
  灭菌
0.1％结晶紫染色溶液
为了补足50毫升结晶紫溶液，将50毫克结晶紫粉末溶解在（5毫升乙醇/45毫升水）中

参考文献

磷酸盐缓冲盐水（PBS）。（2006） Cold Spring Harb Protoc ：doi：10.1101/pdb.rec8247。
Kern，S.，Eichler，H.，Stoeve，J.，Kluter，H。和Bieback，K。（2006）。来自骨髓，脐带血或脂肪组织的间充质干细胞的比较分析干细胞 24（5 ）：1294-1301。

Siler，U.，Seiffert，M.，Puch，S.，Richards，A.，Torok-Storb，B.，Muller，CA，Sorokin，L。和Klein，G。（2000） "ke-insertfile" href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11110691"target ="_ blank">人骨髓中层粘连蛋白亚型的表征和功能分析血液 96（13）：4194-4203。