材料和试剂

UV-Star PS微孔板（96孔）（Greiner Bio-One GmbH，目录号：655801）
0.22μm过滤器
大肠杆菌 BL21（DE3）
（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
纯化的重组His标签的M1P酶
注意：该蛋白质在含有重组pFO4_ M1Pase载体的大肠杆菌BL21（DE3）中产生，如Groisillier等人（2010）。该重组蛋白通过亲和层析纯化 His GErep FF 16/10柱（GE Healthcare）上，在Äktaavant系统（GE Healthcare）上。完整的纯化方案详细描述于Groisillier et al。（2014）。
MgCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
MilliQ水
孔雀绿磷酸盐测定试剂盒（Gentaur，目录号：POMG-25H）
注意：孔雀绿磷酸盐测定方案可在 https://www.bioassaysys.com/Datasheet/POMG.pdf

要测试以评估底物特异性的化学品的实例

D-甘露醇-1-磷酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：92416）

His GErep FF 16/10柱（GE Healthcare）上，在Äktaavant系统（GE Healthcare）上。完整的纯化方案详细描述于Groisillier et al。（2014）。

MgCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）

MilliQ水

孔雀绿磷酸盐测定试剂盒（Gentaur，目录号：POMG-25H）
注意：孔雀绿磷酸盐测定方案可在 https://www.bioassaysys.com/Datasheet/POMG.pdf

要测试以评估底物特异性的化学品的实例

D-甘露醇-1-磷酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：92416）
5 M NaCl（见配方）

设备

NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop 2000）
Safire2紫外分光光度计酶标仪（Tecan Trading AG）

软件

Hyper32（Informer Technologies， http://hyper32.software.informer.com/）
Microsoft Excel

程序

标准反应混合物含有100mM Tris-HCl（pH7.5），1mM M1P，5mM MgCl 2和6至78μg通过NanoDrop定量的纯化重组酶（基于18,700的消光系数（对于目标蛋白质计算的），最终体积为450μl。无活性煮沸的纯化重组酶用作阴性对照（表1）
表1.用于测定M1Pase活性的阴性对照和反应混合物的组成

用水，Tris-HCl，MgCl 2和酶制备混合物，然后通过加入底物开始反应，并且在30℃下进行温育12分钟，每3 min。为此，反应混合物的体积为450μl，并且在t 0℃，t 3min，t 6min下对80μl反应混合物进行取样，，t <9min和t <12min。每个条件以三次重复测试（图2A）。

图2.在1mM M1P存在下，620nm处吸光度的测量作为时间（分钟）的函数。曲线表示两个系列的一式三份，其含有24μg纯化的M1Pase和24μg的煮沸的纯化的M1Pase。在反应混合物中加入M1P之后立即进行在t 0下的Abs 620nm。 B.该表包含在测试的两个条件下和在不同的实验时间测量的吸光度值

在每个样品中，通过加入20μl孔雀绿试剂来终止反应，用于随后测定释放的磷酸盐的量。为此目的，在室温下孵育20分钟后，在Safire2UV分光光度计酶标仪中在620nm读取每个样品的吸光度（图2B）。然后将数值与根据孔雀绿磷酸盐测定试剂盒制造商的说明制备的游离磷酸盐的标准曲线进行比较（图3）。

图3.使用孔雀石绿磷酸盐测定试剂盒测定游离磷酸盐浓度 A.在室温下，对于不同浓度的磷酸盐（从孔1至8，每个浓度2个孔）：0μM，4μM，8μM，12μM，16μM，24μM，32μM和40μM（仅缓冲液，100mM Tris-HCl pH 7.5,5mM MgCl 2， /终浓度）。 B.代表在620nm处监测的吸光度的标准曲线，作为游离磷酸盐（Pi）的可变量的函数。在该实施例中，线性回归曲线为Abs 620nm = [0.0001×（ppm Pi in100μl）] -0.0085，和R sup2 = 0.9985。 C.对应于对不同量的游离磷酸盐测量的吸光度值的表
使用如图3中确定的线性回归曲线计算基于游离磷酸盐产生的磷酸酶活性：
[（ΔA620nm测试-ΔA620nm阴性对照）+ 0.0085] /（0.0001 * t）
其中
ΔA620nm=孵育期间的吸光度变化
t =培养时间（min）
一个活性单位（U）对应于每分钟释放的1nmol Pi
为了计算比活性，将上式中获得的值除以样品中存在的蛋白质的量。对每个测定进行三次重复，并确定这三个重复的平均值±标准误差（S.E。）。从图2中给出的值，在1mM M1P存在下，M1Pase的比活性为11.30U/mg。
为了测定底物特异性，在"材料和试剂"部分中列出的每种底物的存在下测试M1Pase活性，使用浓度范围为0.05mM至1mM，在室温下
为了确定最佳温度，在步骤1中使用的反应混合物在例如10℃至50℃的温度范围内，以5或10℃的增量孵育。下述实验在30℃的最佳温度下进行
在5mM MgCl 2存在下，通过使用pH范围为5.8至9的100mM Tris/HCl缓冲液测定pH对纯化的M1P酶的酶活性的影响。
为了检查NaCl的影响，在步骤1中描述的反应混合物中加入NaCl，以获得范围为0至1μM的终浓度。
为了估计所选底物S的酶的动力学参数，在至少五种不同浓度的该底物存在下进行单个酶反应（例如：0.08mM，0.12mM，0.18mM，0.27mM，0.4mM和0.6mM）。确定每个反应的初始反应速率，并绘制1/V对1/[S]，以获得Lineweaver-Burk图，其中对于S来说K sub和V sub可以计算（图4）。此计算可以使用Hyper32软件完成。

图4.用于测定M1P的M1 mase的K m（0.67mM）和V m（25.25U/mg）的Lineweaver-Burk图。强> [S]是M1P浓度（以mM计），V是反应速率（以U/mg蛋白质计）。对每次测定进行三次重复

笔记

尊重每个反应的孵育时间。在不同的孵育时间从反应混合物取出的样品保持在冰中直到实验结束。然后加入孔雀石20分钟，然后读取620nm处的吸光度。
在室温下加入孔雀石绿和读取620nm处的吸光度之间的时间为20分钟。
对反应混合物的组成，例如缓冲液，pH的每个变化执行标准曲线。
该方案可用于检测全细胞提取物中的M1Pase活性。但是，这是必要的在使用孔雀石绿色试剂盒以量化由细胞提取物中所含酶释放的磷酸盐时要谨慎，因为这些提取物中存在的化学物质可能引起干扰。同样重要的是考虑细胞提取物可以含有游离磷酸盐，其将由孔雀绿试剂盒定量。

食谱

1M Tris-HCl（pH7.5）

将121.14g Trizma底溶于约800ml MilliQ水中
用HCl调节pH 7.5，
用MilliQ水补足至1升
通过0.22μm过滤器过滤并在室温下贮存

100mM MgCl 2

将95.21mg MgCl 2溶解在10ml MilliQ水中
通过0.22μm过滤器过滤并在室温下贮存

5 M NaCl

将95.21mg NaCl溶于10ml MilliQ水中
通过0.22μm过滤器过滤并在室温下贮存

致谢

这项工作得到了法国国家研究机构通过投资支出计划IDEALG（ANR-10-BTBR-02）的支持。作者还感谢Émergence-UPMC-2011研究计划的资助。

参考文献

Großillier，A.，Herve，C.，Jeudy，A.，Rebuffet，E.，Pluchon，PF，Chevolot，Y.，Flament，D.，Geslin，C.，Morgado，IM，Power，D.，Branno， M.，Moreau，H.，Michel，G.，Boyen，C.and Czjzek，M。（2010）。 MARINE-EXPRESS：利用高通量克隆和表达策略进行海洋生物的后基因组分析。 Microb Cell Fact 9：45.

Groisillier，A.，Shao，Z.，Michel，G.，Goulitquer，S.，Bonin，P.，Krahulec，S.，Nidetzky，B.，Duan，D.，Boyen，C.and Tonon， 2014）。褐藻中的甘露醇代谢涉及新的磷酸酶 65（2）：559-570。