材料和试剂

70μM细胞过滤器（Corning，Falcon ，目录号：352350）
1ml注射器（BD，目录号：309659）
30G×1/2针（BD，目录号：305106）
LD柱（Miltenyi biotec，目录号：130-042-901）
MS柱（Miltenyi biotec，目录号：130-042-201）
15和50ml聚丙烯锥形管（Corning，Falcon ，目录号：352096和352070）
小鼠
注意：我们使用6-8周龄的雌性Balb/c或C57BL6小鼠，但是该方案适用于任何小鼠品系，只要供体和受体小鼠来自相同的遗传背景。
单元格
注意：我们分别使用乳腺癌细胞系4T1或E0771与Balb/c或C57Bl6同源。
胎牛血清（FCS）（GE life sciences，HyClone ，FetalClone III，目录号：SH30109.03）
青霉素 - 链霉素（Pen-Strep）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140-22）
注意：将5ml该溶液用于500ml RPMI 1640培养基中。
PBS（Corning，Cellgro，目录号：21-031-CV）
ACK缓冲液（Quality Biological，目录号：118-156-101）
CD4 CD25 + 调节性T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec，目录号：130-091-041）
套件的组件：
1. 1ml CD4 +细胞生物素 - 抗体混合物
2. 2 ml抗生物素微珠
3. 1ml CD25-PE
4. 1 ml抗PE微珠
RPMI 1640（Corning，Cellgro，目录号：10-040-CV）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma Aldrich，目录号：A9647-500G）
注意：使用0.5％的PBS溶液。
EDTA（Sigma Aldrich，目录号：E-5134）注意：使用2mM的PBS溶液。
任选：CD3FITC（克隆：145-2C11）（BD Pharmingen）
任选：CD25 PE（克隆：PC61.5）（BD Pharmingen）
可选：CD4 PerCP（克隆：H129.19/RM4-5）（BD Pharmingen）
可选：FoxP3 APC（克隆：FJK16s）（BD Pharmingen）
MACS缓冲区（参见配方）

设备

MidiMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-302）
MiniMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-102）
离心机（Eppendorf，型号：5810R）

程序

诱导调节性T细胞
4T1或E0771细胞在补充有10％FCS和1％Pen-Strep的RPM培养基中生长。皮下注射重悬于PBS（90％或更高的存活力）中的1-5×10 4个4T1或0.5-1×10 6个E0771细胞到Balb/c或C57BL6小鼠中（如果需要更多的Treg注射更多的小鼠，则平均需要3-5只小鼠来获得约1-5×10 6个 Treg）。
用于Treg纯化的样品制备
在12-16天后，通过颈部脱臼（AVMA动物安乐死指南：2013版）安乐死小鼠，并除去淋巴结（腹股沟和腋窝）（Mathieu等人，2012）和/或脾。通过机械破坏肿瘤制备单细胞悬浮液（确保使用单细胞悬液，通过通过70微米的细胞过滤器）。可选：如果存在红细胞，用ACK缓冲液溶解，但不是必需的，因为该试剂盒含有抗Ter-119抗体以正性消耗红细胞。
注意：工作速度快，保持细胞冷，并使用预冷解决方案。这将防止细胞表面的抗体上覆，并减少非特异性细胞标记。
非CD4 + 细胞的磁性标记和CD25 + 细胞的荧光标记
我们完全遵循制造商提供的方案以纯化CD4 + CD25 + sup/+调节性T细胞。下面给出的磁性标记的体积用于起始细胞数为10 7个白细胞。当使用少于10个的白细胞工作时，使用与所示相同的体积。当使用较高的细胞数量时，相应地扩大所有试剂量和总量
1. 确定白细胞数。
2. 在室温（RT）下将细胞在300×g离心10分钟。完全吸出上清液。
3. 重悬细胞沉淀在40微升MACS缓冲区每10 总细胞。
4. 每10μL总细胞加入10μl生物素 - 抗体混合物（该混合物含有针对CD8a，CD11b，CD45R，CD49b和Ter-119的抗小鼠抗体）。
5. 通过上下吹吸混匀，冷藏10分钟（4-8℃）。
6. 每10 7个总细胞加入30μl的MACS缓冲液，20μl的抗生物素微珠和10μl的CD25-PE抗体。
7. 充分混合并在黑暗中（4-8℃）冷藏另外15分钟。
8. 通过每10 7个总细胞加入1-2ml缓冲液洗涤细胞，并在300×g离心10分钟RT。完全吸出上清液。
9. 将悬浮细胞沉淀在500μlMACS缓冲液中（根据制造商，可将高达1.25×10 8个细胞悬浮在该体积中）。
10. 继续进行磁分离。
  
  图1.细胞纯化的MACS midi系统
用LD柱消耗
1. 将LD柱置于midi MACS分离器的磁场中（图1）。
2. 通过用2ml MACS缓冲液冲洗制备柱。
3. 将细胞悬液应用于色谱柱。
4. 收集未标记的细胞，其通过并通过吸取1ml MACS缓冲液洗涤柱2次。当柱容器为空时，连续添加MACS缓冲液执行清洗步骤。收集总流出物。这是未标记的CD4 + T细胞部分。
5. 继续进行CD4 + CD25 + T细胞的富集。
CD25 + 细胞的磁性标记
下面给出的磁性标记体积是最多10个 7 初始起始细胞数。对于较大的初始单元格数量，相应地按比例增加
1. 离心分离的CD4 + T细胞在300×g离心10分钟。完全吸出上清液。
2. 重悬细胞沉淀在90微升的MACS缓冲液。
3. 加入10μl的抗PE微珠。
4. 充分混合并在黑暗中（4-8℃）冷藏15分钟。
5. 通过加入1-2ml MACS缓冲液洗涤细胞，并在300×g离心10分钟。完全吸出上清液。
6. 在500μlMACS缓冲液中重悬最多10个细胞。
7. 继续进行磁分离。
磁性分离：CD4 + CD25 + sup/+调节性T细胞的阳性选择
1. 将MS柱置于合适的MACS分离器的磁场中。
2. 通过用500μlMACS缓冲液漂洗来制备柱。
3. 将细胞悬液应用于色谱柱。
4. 让细胞通过，用500μlMACS缓冲液洗涤柱3次。执行洗涤步骤，通过添加MACS缓冲液三次，一旦柱容器是空的。
5. 从分离器中取出色谱柱，并将其放在合适的收集管上。
6. 移取1ml的MACS缓冲液到柱上。通过将柱塞牢固地推入柱子，立即冲出磁性标记的细胞（CD4 + CD25 + ）。
7. 可选：要达到最高纯度，使用连续柱运行重复磁选分离
Treg与4T1或E0771肿瘤细胞的共注射
1. 确定注射所需的Treg和肿瘤细胞的细胞数。
2. 注射约100-200微升含有混合物纯化的Treg的PBS，其中肿瘤细胞皮下接近乳腺脂肪垫。
3. 通过卡尺测量跟踪肿瘤生长。

代表数据

图2.代表性的Treg纯化

笔记

Tregs纯度从85-95％变化（参见图2）。
在我们的实验中，我们将5×10 4个4T1细胞与1×10 6个Treg或0.5×10 6个E0771细胞一起转移到1×10 6个 6 Tregs。

食谱

MACS缓冲区
补充有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS 保持缓冲液冷（4-8°C）

致谢

这项工作得到斯坦福癌症研究所的翻译癌症奖和国防部授予的乳腺癌研究计划W81XWH-14-1-0397的支持。改编自（Winn，1960）。

参考文献

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Mathieu，M。和Labrecque，N。（2012）。鼠表面淋巴结手术。 Vis Exp （63）：e3444。
Olghanud，PB，Baatar，D.，Bodogai，M.，Hakim，F.，Gress，R.，Anderson，RL，Deng，J.，Xu，M.，Briest，S。和Biragyn，。乳腺癌肺转移需要趋化因子受体CCR4和调节性T细胞的表达。 Cancer Res 69（14）：5996-6004。
Smyth，M.J.，Teng，M.W.，Swann，J.，Kyparissoudis，K.，Godfrey，D.I。和Hayakawa，Y。（2006）。 CD4 + CD25 + 176（3）：1582-1587。 T调节细胞抑制NK细胞介导的癌症免疫治疗。
Vences-Catalan，F.，Rajapaksa，R.，Srivastava，M.K.，Marabelle，A.，Kuo，C.C.，Levy，R.and Levy，S。 Tetraspanin CD81通过调节T调节功能来促进肿瘤生长和转移和髓样衍生的抑制细胞。 Cancer Res 75（21）：4517-4526。
Winn，H.J。（1960）。免疫反应和同种异体移植反应 Natl Cancer Inst Monogr 2：113-138。