材料和试剂

70μM细胞过滤器（Corning，Falcon ，目录号：352350）
1和10ml注射器（BD，目录号：309659和309604）
15和50ml聚丙烯锥形管（Corning，Falcon ，目录号：352096和352070）
18纱布针（BD，目录号：305196）
24孔板（Corning，Falcon ，目录号：351147）
小鼠
注意：我们使用6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，但是可以使用任何小鼠品系，只要巨噬细胞和MDSC来自相同的遗传背景即可。
单元格
注意：我们使用4T1乳腺癌细胞系与Balb/c同源; 已知这种肿瘤模型在血液，脾和肿瘤中诱导MDSC的强积聚
硫代乙醇酸酯（BD，目录号：211716）
注意：使用3％的水溶液并在121℃的高压灭菌器中灭菌15分钟。
PBS（Corning，Cellgro，目录号：21-031-CV）
RPMI 1640（Corning，Cellgro，目录号：10-040-CV）
DMEM培养基（Corning，Cellgro，目录号：10-017-CV）
青霉素 - 链霉素（Pen-Strep）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140-22）
注意：将5ml该溶液用于500ml RPMI 1640培养基中。}
胎牛血清（FCS）（GE Life Sciences，HyClone ，FetalClone III，目录号：SH30109.03）
ACK缓冲液（Quality Biological，目录号：118-156-101）
IL-12p70和IL-10ELISA试剂盒（Biolegend，Legend Max TM，目录号：431417和433607）
CD11b PE（克隆：M1/70）（BD，目录号：553311）
F4/80 APC（克隆：BM8）（eBioscience，目录号：17-4801-82）
抗Ly6G和Ly6c（Gr1）APC（克隆：RB6-8C5）（BD，目录号：553129）
LPS 1mg/ml（Sigma-Aldrich，目录号：L3012-5MG）注意：如果使用不同的肿瘤模型，其中血液或脾脏中的MDSC分别代表总外周血单核细胞或脾细胞的小百分比，用骨髓衍生的抑制细胞分离试剂盒纯化MDSC，并根据制造商方案 Miltenyi biotec，目录号：130-094-538）。

设备

离心机（Eppendorf，型号：5810R）

程序

注意：腹膜巨噬细胞以及MDSC的分离应在无菌条件下进行。

巨噬细胞分离
1. 在巨噬细胞分离前4-5天腹膜内（ip）腹腔注射3-4天的Balb/c小鼠与1ml无菌的3％巯基乙酸盐。
2. 4-5天后，通过颈椎脱臼使安乐死小鼠（AVMA Guide for the Euthanasia of Animals：2013 Edition）。小心地在皮肤上做一个小切口以暴露腹膜壁，避免切开腹膜壁，以防止PBS的渗漏。通过注射5-10毫升无菌冷PBS腹膜腔收获腹膜细胞;给小的按摩以脱落腹膜细胞（使用18纱布针提取，用PBS洗涤几次）。每次洗腹膜时收集PBS（Lu，2013）。
3. 在300×g下旋转细胞5分钟，计数细胞并重悬于含有10％FCS和1％Pen-Strep的RPMI或DMEM培养基中。如果存在红细胞，用ACK缓冲液裂解。简而言之，加入3-5ml ACK裂解缓冲液并孵育5分钟。通过加入两倍体积的PBS淬灭反应。旋转5分钟，300 x g ，然后重复洗一次。
4. 以7.5×10 5个细胞/孔/500μlRPMI或DMEM/10％FCS和1％Pen-Strep在24孔板中的平板细胞，并在37℃在5％CO ₂ 3小时。
5. 去除非粘附细胞，并用RPMI或DMEM培养基洗涤附着的细胞一次。
6. 保存等分试样（分离细胞加入PBS中的2mM EDTA约10-15分钟，收集细胞并以300×g离心5分钟）重悬于PBS中，并评估您的纯度通过流式细胞术用CD11b和F4/80抗体（每百万个细胞1μg抗体）染色的巨噬细胞群，如图1所示。
  
  图1.腹膜巨噬细胞分析
肿瘤来源的血液MDSC分离
1. 将1×10 4个-1×10 5个的4T1细胞皮下注射到雌性Balb/c小鼠的乳腺脂肪垫中（Reuter，2011）。在第21-28天，几乎90％的白细胞是MDSC（双重阳性CD11b ⁺ Gr1 ⁺），如图2所示。确定Gr1阳性MDSC的百分比通过用抗Gr-1-APC和CD11b-PE抗体染色并通过流式细胞术分析（每百万个细胞1μg抗体）。
  
  图2.在4T1-肿瘤小鼠的第28天的血液中分析MDSC
2. 在肿瘤植入后第21-28天，通过心脏穿刺从携带肿瘤的动物收集100-500μl血液，并用ACK缓冲液在RT下裂解红细胞3-5分钟（对于500μl血液，5ml的ACK）。用PBS洗涤细胞两次，在室温下以300×g旋转两次，每次5分钟，计数细胞，并重悬于完全培养基中。
  可选：如果MDSC占总白细胞的较小百分比，则用骨髓衍生抑制细胞分离试剂盒纯化MDSC。
3. 将具有7.5×10 5个细胞培养物的共培养MDSC（1.5×10 6个MDSC /孔/500μlRPMI或DMEM/10％FCS和1％Pen-Strep培养基）巨噬细胞，通过将它们在相同的孔中混合在一起（或以不同比例MDSC：巨噬细胞，2:1,1:1等）一式三份，加入100ng/ml LPS并孵育在37℃，5％CO 2下16-18小时。包括只含有巨噬细胞和仅MDSC作为对照的孔（如如图3所示）以及在存在和不存在LPS的情况下，如图4所示。
4. 16-18小时后收集培养物上清液，并通过ELISA（通过旋转3分钟800×g除去细胞碎片）测量IL-12和IL-10分泌。任选地是根据制造商的方案检测IFN-γ分泌
  
  图3.巨噬细胞与MDSC的共培养的代表性方案
  
  图4.通过MDSCs测定法代表的巨噬细胞极化分析

致谢

这项工作得到斯坦福癌症研究所的翻译癌症奖和国防部授予的乳腺癌研究计划W81XWH-14-1-0397的支持。该方案改编自先前的研究（Sinha等人，2007）。

参考文献

Gabrilovich，D.I.，Ostrand，R.S.and Bronte，V。（2012）。肿瘤对骨髓细胞的协调调节。 Nat Rev Immunol 12（4）：253-268。
Lu，M。和Varley，A.W。（2013）。小鼠腹膜巨噬细胞的收获和培养。生物协议 3（22）：e976。
Reuter，J。（2011）。皮下注射肿瘤细胞生物方案 Bio101：e166。
Sinha，P.，Clements，V.K.，Bunt，S.K.，Albelda，S.M.and Ostrand-Rosenberg，S。（2007）。骨髓衍生的抑制细胞和巨噬细胞之间的串扰破坏肿瘤免疫朝向2型反应。免疫学杂志 179（2）：977-983。
Vences-Catalan，F.，Rajapaksa，R.，Srivastava，M.K.，Marabelle，A.，Kuo，C.C.，Levy，R.and Levy，S。 Tetraspanin CD81通过调节T调节功能来促进肿瘤生长和转移和髓样衍生的抑制细胞。 Cancer Res 75（21）：4517-4526。