第I部分。线粒体与小鼠组织的分离

材料和试剂

10ml管
1.5 ml Eppendorf管
蔗糖（Merck Millipore Corporation，目录号：107651）
脱水的乙二胺四乙酸二钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：ED2SS）
D-山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：E4378）
（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
蛋白质测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
中A（参见配方）
中等（见配方）

设备

15ml Dounce全玻璃组织研磨机（Kimble，目录号：885303-0015）
Beckman Avanti J-25离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-25）
JA-25.50转子，固定角度，铝，单锁盖，8×50ml，25,000rpm，75,600×g（Beckman Coulter，目录号：363055）
Bio-Vial TM管，PP，4ml，14×55mm，0.56×2.2英寸（Beckman Coulter，目录号：566353）
离心机5415R（Sigma-Aldrich，Eppendorf ，型号：5415R）

程序

动物研究是根据欧洲共同体的动物政策和伦理准则进行的。该项目由机构审查委员会（UAM的伦理委员会，CEI-24-571）批准。
从小鼠肝和/或心脏分离线粒体根据（Fernandez-Vizarra等人，2010）进行微小修改。
通过颈脱位法处死成年小鼠，取出肝脏（大约一半没有胆囊的肝脏）或全心脏，并立即在均质化培养基A（肝脏）或培养基H（心脏）中在4℃冷却。此时，将几个10ml离心管置于冰上，直到步骤6
用预冷的1×PBS中的一把剪刀将组织洗涤，称重并切成小块，以除去血液和结缔组织。
在组织研磨机中用4ml/g冷匀浆培养基A（肝）或用10ml/g冷匀浆培养基H（心脏）进行匀浆。有必要用杵A进行5步，接着用肝杵用杵B进行5步，用杵A进行12步，然后用心杵用杵B进行12步。
将匀浆转移至预冷的10ml管中，并在4℃以1,000xg离心10分钟。然后用上清液重复该步骤，以便丢弃未破损的组织，细胞和细胞核
将所得上清液转移至1.5ml Eppendorf管中，并在微量离心机中在4℃下以6,700×g离心10分钟以沉淀线粒体。

笔记

使用冷介质并且没有长时间的中间停止，在4℃下进行整个分离过程是非常重要的
线粒体不应再进行离心以保持细胞器的功能完整性。

食谱

中等A（100 ml）
0.32M蔗糖（MW = 342.2965g/mol）：10.95g
1mM EDTA（MW = 292.24g/mol）：30mg
10mM Tris-HCl（pH7.4）（MW = 121.14g/mol）：0.12g
中H（100 ml）
0.072M蔗糖（MW = 342.2965g/mol）：2.46g
1mM EGTA（MW = 380.4g/mol）：40mg
0.1％w/v无脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA）：0.1g/mL 10mM Tris-HCl（pH7.4）（MW = 121.14g/mol）：0.12g

第二部分。确定H的ATP合成活性 ⁺ span style ="color：＃666666; font-family：Arial; font-size：14px;"> - ATP合成器

材料和试剂

微孔板，96孔，聚苯乙烯，黑色平底，TC处理（Cultek，目录号：153603）
蛋白质测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
磷酸酶抑制剂混合物2（Sigma-Aldrich，目录号：P5726）
（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics ，目录号：11836170001）的微量培养基
Digitonin（Sigma-Aldrich，目录号：D141）
（腺苷-5'）五磷酸盐五钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：D4022），其中p
腺苷5'-二磷酸钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A2754）
腺苷5'-三磷酸（ATP）二钠盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：FLAAS）
HClO 4
KOH
寡霉素（VWR International，目录号：80058-538）
琥珀酸（Sigma-Aldrich，目录号：398055）
Rotenone（Sigma-Aldrich，目录号：R8875）
ATP生物发光测定试剂盒CLS II（Roche Diagnostics，目录号：11699695001）
来自萤火虫的萤光素酶（Sigma-Aldrich，目录号：10411523001）
甲虫荧光素，钾盐（Promega，目录号：E1601）
pH指示剂溶液（pH 4.0-10.0）（Merck Millipore Corporation，目录号：1091750100）
（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
蔗糖（Merck Millipore Corporation，目录号：107651）
KCl（Merck Millipore Corporation，目录号：104936）
MgCl 2（Merck Millipore Corporation，目录号：172571）
磷酸钾缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：P0662/P3786）
乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma Aldrich，目录号：E4378）
呼吸中（RM）（见配方）

设备

FLUOstar Omega微孔板读数器（BMG Labtech，型号：FLUOstar Omega）
Heraeus Megafuge 11R（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus Megafuge 11R）
离心机5415R（Sigma-Aldrich，Eppendorf ，型号：5415R）

程序

终点确定ATP合成活性
1. 如果与来自动物组织的分离的线粒体一起工作，将分离的细胞器以1μg/μl的蛋白质重悬于含有1×磷酸酶和蛋白酶抑制剂的呼吸培养基（RM）中。线粒体制剂保持在4℃。直到步骤A7，不需要进一步的程序
2. 如果与细胞一起工作，将细胞（约1-3×10 6个细胞）胰蛋白酶化并用PBS洗涤两次，并将细胞沉淀物重悬浮于含有1×磷酸酶和蛋白酶抑制剂的1ml RM中。通过添加浓度为50-75μg/ml RM的毛地黄皂苷实现细胞透化。
3. 通过重复倒置在1分钟期间摇动管。为了去除毛地黄皂苷，需要在100分钟内立即离心细胞5分钟，然后在室温下用RM洗涤两次。
4. 在这一点上，分离小部分透化细胞，并使用基于比色的测定法例如Bradford蛋白质测定法或二辛可宁酸测定法（BCA）用于总蛋白质浓度的定量。
5. 准备两套管;需要一个用于没有寡霉素（OL）的反应，一个用于与寡霉素的平行反应。此外，制备两组七个管，每个管含有200μl的在步骤A9下使用的6％HClO 4。
6. RM用于通过补充150μM的P 1，P 5 - 二（腺苷-5'）五磷酸（腺苷酸激酶抑制剂）来制备反应缓冲液ADP转化为ATP），2mM鱼藤酮，5mM ADP和2mM琥珀酸盐作为呼吸底物（复合物II）。可以使用其他呼吸底物。
7. 对每个样品测定使用补充有30μMOL的反应缓冲液的平行反应。该反应表明合成的ATP可能独立于H sup + +/-ATP合酶活性而发生。
8. ATP合成反应的触发通过向含有450μl反应缓冲液（如步骤A6和A7所述）的管中加入150-200μg透化细胞或50μg分离的线粒体的蛋白质来实现在30℃下在恒定摇动下摇动管。
9. 每30秒取少量等分试样（50μl），直至3分钟（反应终止），并加入含有200μl6％HClO 4的试管中。
10. 将管立即涡旋并置于4℃下1小时以沉淀蛋白质
11. 然后，将管在11,000×g离心5分钟，将所得上清液转移到另一个管中，在2μlpH指示剂的存在下用10％KOH（〜130μl）中和。
12. 使用ATP生物发光测定试剂盒CLS II在具有光度计读板器的96孔板中测定每个样品中ATP的含量。为此，在每个孔中混合50μl中和的样品与50μl包含在试剂盒中并含有荧光素酶的反应缓冲液。在同一板中产生并加工ATP标准曲线（0-10μM），加入50μlATP标准品和50μl试剂盒中包括的反应缓冲液。
13. ATP合成的初始速率通过估计每个样品中产生的ATP的pmol来确定。 ATP的ATP合成活性表示为nmoles of ATP/min/mg蛋白质（如代表性数据中所示，图1）。
动力学测定ATP合成活性
1. 为了以动力学模式测定线粒体ATP合成活性，我们遵循（Vives-Bauza等人，2007）详述的方案，进行一些修改。
2. 根据先前的协议进行步骤B1-4
3. 将渗透的细胞或50-150μg的分离的线粒体重悬于40μlRM中。将管保持在冰上直到使用。
4. 在RM（参见配方2和3）中制备两种混合物A和B与反应化合物
5. 在每个孔中加入160μl的混合物A和20μl的混合物B. 光度计读板器设置为在〜10分钟内每10秒以动态模式测量发光，其中发光线性地增加〜250秒。
6. 将板放置在光度计，并添加20微升透化细胞或步骤B3中获得的分离的线粒体开始ATP合成的反应。
7. 使用ATP标准曲线将相对光单位转化为ATP浓度。为此，在混合物A中制备0和10μM之间的ATP溶液三份，终体积为180μl。最后，向每个孔中加入20μl混合物B并测量终点的发光（参见图2）。
8. ATP合成的初始速率通过估计每个样品中产生的ATP的pmol来确定。酶的ATP合成活性表示为ATP/min/mg蛋白质的pmoles（如代表性数据中所示，图2）。

代表数据

为了将获得的RLU转化为ATP，有必要遵循以下步骤：
1. 从不存在OL（T0，T1，T2，T3）时采取的时间点减去试管中的T0，T1，T2和T3时间点中的RLU + OL（由于线粒体中含有的ATP，（图1A）。在不存在OL的情况下（图1A），验证RLU线性地和显着地增加是非常重要的，而在OL的存在下RLU发生细微的或可忽略的变化（图1A）。
2. 在线性回归（图1B）中插值获得的RLU值（图1A），以获得已测量的样品体积中的ATP含量。
3. 将所获得的pmol的ATP乘以固定值7.6，其是总体积与测量的样品体积之间的比率。（总体积=250μl+130μl=380μl）; （样品体积=50μl）; （比率= 7.6）（来自步骤A9和A11）。
4. 将在点3下获得的值乘以指示在每个时间点取得的样品的体积的因子，相对于在T1处的反应总体积（即，，因子，因为450/50 = 9 ;因子8在T2，因为400/50 = 8;因子7在T3，因为350/50 = 7，...）（来自步骤A9）。
5. 归一化由蛋白质量和反应时间获得的ATP的总pmol（图1C）
6. 当使用透化细胞制剂的活性时，遵循相同的计算程序
  
  图1.在寡聚霉素（OL）不存在（-OL）或存在（+ OL）时来自小鼠心脏的分离的线粒体中的ATP合酶活性（终点模式）。A.相对光单位（RLU ）的样品在0,1,2和3分钟后，在不存在和存在OL的情况下触发反应。 B. ATP量和荧光素/荧光素酶依赖性发光之间的相关性的线性回归分析。 C.使用三种心脏线粒体制剂的ATP合成活性（平均值±S.E.M）的实施例
为了将获得的RLU转化为ATP，必须遵循以下步骤：
1. 从T0减去所有其他时间点的RLU（图2A）。
2. 为了将反应的RLU转化为ATP量，需要在线性回归中在60秒内插RLU（图2B）。
3. 根据样品中的蛋白质量，归一化数据是重要的（图2C）。
  注意：如果您使用RLU 60秒来内插到图2B，您的数据已经是一个速率（pmol ATP/min）。
4. 当使用分离的线粒体制剂的活性时，遵循相同的计算程序
  
  图2.在没有（蓝色）或存在寡霉素（粉红色）的情况下在毛地黄皂苷透性化的HCT116细胞中的ATP合酶活性（动力学模式）。A.以相对光单位产生ATP的动力学表示（RLU）。灰色虚线表示ADP的磷酸化反应的初始速率，其为线性的至少60秒，并且其可以从线的斜率计算。 B. ATP量和荧光素/荧光素酶依赖性发光之间的相关性的线性回归分析。 C.使用三种制剂的洋地黄皂苷透性HCT116细胞的ATP合成活性（平均值±S.E.M.）的实施例。

笔记

毛地黄皂苷的浓度和透化时间是关键的，并且可能根据细胞系而改变。因此，我们建议先前滴定在每个细胞中使用的洋地黄皂苷浓度线更适合ATP合成活性的测定。
建议在使用前新配制ADP

食谱

呼吸中（RM）（100 ml）
225mM蔗糖（MW = 342.2965g/mol）：7.7g/dm 2 10mM KCl（MW = 74.5g/mol）：74mg
5mM MgCl 2（MW = 95.2g/mol）：47.6mg
0.05％w/v牛血清白蛋白：50mg
10mM磷酸钾缓冲液[HK 2 PO 4 4（MW = 174.17g/mol）：0.17g; H sub 2 KPO 4（MW = 136.1g/mol）：0.16g]
1mM EGTA（MW = 380.35g/mol）：38mg
10mM Tris-HCl（pH7.4）（MW = 121.14g/mol）：38mg
混合A
呼吸中（ 0.1 mM ADP
5mM琥珀酸盐 0.15μMP ^{1，P - 二（腺苷-5'）五磷酸盐
2μg/ml鱼藤酮与或不与30μM寡霉素一起培养}
混合B
RM
0.25mg/ml荧光素
0.02mg/ml荧光素酶。

第三部分。测定H ⁺ -ATP合酶的ATP水解活性

材料和试剂

微孔板，96孔，聚苯乙烯，黑色平底，TC处理（Cultek，目录号：153603）
蛋白质测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
液氮
磷酸酶抑制剂混合物2（Sigma-Aldrich，目录号：P5726）
（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics ，目录号：11836170001）的微量培养基
寡霉素（VWR International，目录号：80058-538）
（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
腺苷5'-三磷酸（ATP）二钠盐水合物（Sigma-Aldrich，目录号：FLAAS）
KCl（Merck Millipore Corporation，目录号：104936）
MgCl 2（Merck Millipore Corporation，目录号：172571）
羰基氰4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）（Sigma-Aldrich，目录号：C2920）
抗霉素A（Sigma-Aldrich，目录号：A8674）
磷酸（烯醇）丙酮酸环己基铵盐（Sigma-Aldrich，目录号：P3637）
来自兔肌肉的L-乳酸脱氢酶（L-LDH）（Sigma-Aldrich，Roche Diagnostics ，目录号：10127876001）
来自兔肌肉的丙酮酸激酶（Sigma-Aldrich，目录号：P9136）
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原二钾盐（NADH）（Sigma-Aldrich，目录号：N4505）
反应缓冲液（RB）储备溶液（见配方）
FCCP储备溶液（见配方）
抗霉素A储备溶液（见配方）
完全反应缓冲液（见配方）

10mM PEP储液
2.5mM ATP储液
1mM NADH储备液
低聚霉素A储备溶液

设备

FLUOstar Omega微孔板读数器（BMG Labtech，型号：FLUOstar Omega）
Heraeus Megafuge 11R（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus Megafuge 11R）
离心机5415R（Sigma-Aldrich，Eppendorf ，型号：5415R）

程序

可以在340nm处的吸光度变化（A 340）后，通过分光光度法测定酶对ATP的水解。该方法的基础是乳酸脱氢酶（LDH）和丙酮酸激酶（PK）催化的酶反应与ATP合酶的水解活性的偶联（Barrientos等人，2009）。通过ATP水解产生的ADP允许PK将1摩尔磷酸烯醇丙酮酸（PEP）转化为1摩尔丙酮酸。然后丙酮酸被LDH用于在该过程中产生乳酸盐将NADH分子氧化为NAD +。通过每个ATP分子水解，一分子NADH被氧化，允许通过A 340中的减少检测反应。
通过在液氮中和在37℃下分别冷冻和解冻线粒体制剂的三个循环，在分离的断裂的线粒体上测定H sup +/-ATP合酶的水解活性。
将30-50μg分离的线粒体重悬于20μl含有1x磷酸酶和蛋白酶抑制剂的反应缓冲液（RB）中。
设置发光计平板读数器以在动力学模式（每孔10次闪烁）中测量340nm处的吸光度，并且通过恒定的时间间隔（15秒）测量吸光度的变化。在这些条件下，可以同时测量24个样品。
将80μl完全RB（含PK和LDH）和20μl如步骤3制备的线粒体加入每个96孔黑色透明底板中，记录反应。
当产生足够的ATP水解时（2-5分钟），向每个孔中加入30μM寡霉素。加入寡霉素抑制线粒体ATP合酶/水解酶的活性，提供测定特异性的确认。
分离的线粒体的ATP酶活性以NADH氧化的纳米摩尔/min/mg线粒体蛋白表示，其使用Lambert-Beer方程计算并且NADH的摩尔消光系数为6.22×10 3 M < sup> -1 cm ^-1。
N =ΔA340 /（ε340×l）其中N是被氧化的NADH的浓度，ΔA340是两个给定时间点之间的吸光度的减量，ε340是摩尔浓度 NADH在340nm处的消光系数和l是1cm的光程长度

代表数据

图3.来自小鼠心脏的分离的线粒体中的ATP水解酶活性。图的斜率表示A 340作为反应时间的函数的递减。在指示的情况下，加入30μM寡霉素（+ OL，箭头）。分析含有60μg（A，红色）和30μg（B，蓝色）分离的线粒体的两种不同制剂。加入OL（封闭条）通过抑制反应的斜率阻断水解酶活性作为证据。 ATP水解酶活性表示为mU/mg蛋白。条代表平均值±S.E.M。的在来自小鼠心脏的分离的线粒体的三种制剂中测定的ATP酶活性。

笔记

注意，在步骤3添加的RB不补充PK和LDH
ATP和NADH必须新鲜制备。
FCCP，抗霉素A，PEP和寡霉素储备溶液可以在-20℃储存。

食谱

反应缓冲液（RB）储备溶液（10ml） 50mM Tris-HCl（pH8.0）（MW = 121.14g/mol）：61mg
50mM KCl（MW = 74.55g/mol）：37.2mg
2.5 mM FCCP储液
FCCP（MW = 254.17g/mol）
将0.6mg FCCP溶于1ml DMSO中
500μM抗霉素A储备液
抗霉素A（MW = 548.63g/mol）将0.3mg抗霉素A溶于1ml乙醇中
完全反应缓冲液，1ml（足够体积的RB运行十次测定）

0.92ml RB储备液
2μl2.5mM FCCP原液（终浓度：5μM）
2μl500μM抗霉素A原液（终浓度：1μM）
10μl1M PEP（最终浓度：10μM）
将27mg PEP溶解在100μl水中
25μl100mM ATP（终浓度：2.5mM）将5.5mg溶于100μl水中
10μl100mM NADH（终浓度：1mM）将7.4mg溶解在100μl水中
13μl4单位LDH（2,750U/ml）
20μl4单位PK（1,920U/ml）
注意：在最后一步中和在通过加入线粒体触发反应之前进行4单位的LDH和4单位的PK的添加。
2μl1.5mM寡霉素A储液
将1.2mg低聚霉素储备溶液溶解在1ml乙醇中

致谢

我们感谢博士。 MaríaSánchez-Aragó和Laura Formentini为设置ATP合酶活性的测定提供专家指导。认识到M. Chamorro和C.Nuñezde Arenas的技术援助。作者感谢Drs的实验室开发的以前的工作。 Enríquez，Barrientos和Manfredi，用于开发适用于这些方案的方法。 JGB和CNT得到了来自FPI-MICINN/MINECO和Fondo Social Europeo，Spain的博士后奖学金的支持。这项工作得到西班牙经济竞争部长（SAF2013-41945-R），马德里商会（S2011/BMD-2402）和拉美区域基金（FRA）的资助。 CBMSO从FRA获得机构资助。

参考文献

Barrientos，A.，Fontanesi，F。和Diaz，F。（2009）。使用极谱法和分光光度酶测定法评价线粒体呼吸链和氧化磷酸化系统。 19：Unit1913。

Fernandez-Vizarra，E.，Ferrin，G.，Perez-Martos，A.，Fernandez-Silva，P.，Zeviani，M. and Enriquez，JA（2010）。线粒体的分离用于生物生物学研究：更新。线粒体 10 3）：253-262。

Vives-Bauza，C.，Yang，L.和Manfredi，G.（2007）。在动物细胞和组织中线粒体ATP合成的测定。方法细胞生物学 80：155-171。