材料和试剂

96孔板，V形（Corning，Costar ，目录号：3894）
15ml Falcon管（例如，Fisher Scientific，目录号：14-959-53A）
LumaPlate-96（PerkinElmer，目录号：6006633）
Bassin或水库（，例如，Vitaris，目录号：4304-INT或等同物）
抗原呈递靶细胞：例如，人T2（CRL-1992），小鼠P815（ATCC，目录号：TIB-64）或表征的肿瘤细胞系例如。，Me275（Zippelius等人，2002）]
效应细胞[即从患者或健康供体的血液中直接分离的抗原特异性细胞毒性CD8 T细胞的多克隆或克隆群体（Speiser等人，2008 ）]
RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：61870010）
在56℃灭活1小时的胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ，目录号：10270106）
以1mg/ml的初始浓度溶解于1×PBS中的抗原肽溶液[例如，NY-ESO-1 157-165肽（SLLMWITQC）] 注意：对于对照，1mg/ml的不相关的肽溶液不被T细胞（即任何其它I类短肽）识别。
（2ml小瓶，含有2mCi，浓度为1μl），1ml的溶液（Na 2 Cl 2， mCi/ml）（PerkinElmer，目录号：NEZ030S002MC）
1M HCl（Sigma-Aldrich，目录号：258148或等价物）

设备

多通道移液管，8或12个通道[例如，Finnpipette F210-100μl，8通道（Sigma-Aldrich，目录号：Z678007）]
水浴
培养箱37℃，5％CO 2
用于15ml样品管和96孔板的标准实验室台式离心机
Packard TopCount NXT阅读器（Perkin Elmer，USA）

软件

棱镜

程序

用E：T比为10:1的肽滴定的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）测定该第一部分描述了进行细胞毒性T淋巴细胞（CTL）测定所需的不同步骤。使用^{51放射性标记靶细胞（步骤A1）。肽稀释液的制备（步骤A2）。效应CD8T细胞的制备（步骤A3）。将装载程序装入96孔板（步骤A4）。测定 Cr放射性（步骤A5）。分析结果（步骤A6）。
用铬51（⁵¹ Cr）放射性标记T2靶细胞，
计算CTL测定所需的T2靶细胞的数量。对于96孔板的1个孔，需要1,000个靶细胞。考虑增加20％的细胞以解决移液期间的体积损失。
注意：我们通常标记0.5 x 10 ⁶ T2细胞，这足以容纳500个孔。

在15ml Falcon管中收获正确数量的T2靶细胞，并在室温（RT）下在530×g下旋转5分钟。

在1ml RT RPMI/10％FBS培养基中洗涤细胞
旋转，去除所有液体，并与50μl的纯的51 Cr溶液（活性1mCi/ml）在水浴中37℃下孵育T2细胞45分钟。在操纵放射性材料（例如，导线屏蔽，快速操纵）时，采取必要的预防措施和保护措施。请联系您的无线电安全主管了解详细步骤。

在⁵¹ Cr标记时间结束时，加入10ml RPMI/10％FBS并在530×g下旋转5分钟。按照所需的安全预防措施丢弃上清液（有关详情，请联系您的无线电安全官员）
用10ml RPMI/10％FBS再重复洗涤步骤两次。

第三次洗涤后，以0.02×10 6/ml/ml的浓度在RT RPMI/10％FBS中重悬细胞。

在96-V底板的每个孔中的最后一个步骤（参见步骤A4）加入50μl（1,000个细胞）新鲜标记的51 Cr细胞溶液。

制备肽稀释液
将感兴趣的抗原肽[本文中为NY-ESO-1 157-165肽（SLLMWITQC）]溶解在PBS中，以制备10-AA肽的1mg/ml（〜1mM）的储备溶液。

从储备溶液中，在RPMI/10％FBS中制备500x稀释液，以获得2μM的起始浓度用于以下连续稀释步骤。这表示在电镀步骤（步骤A4）期间发生1:2稀释步骤时抗原肽的2x浓缩溶液。
注意：为计算连续稀释所需的抗原肽溶液的体积，请考虑每个条件一式两份进行测试，需要备用体积。每个测试的T细胞需要200μl[每孔100μl肽×2（一式两份）]肽溶液。确保至少有20％的备用卷。 4个CD8 T细胞的实施例：4×[100μl肽×2（重复）] =800μl所需的+备用体积→制备1ml的初始2μM溶液。

用RPMI/10％FBS制备7个管（15ml Falcon），并从2μM肽溶液制备系列10倍稀释液，确保每次彻底涡旋管并更换移液管吸头。
注意：4个CD8 T细胞的实施例：100μl（2μM）+900μlRPMI/10％FBS→100μl（0.2μM）+900μlRPMI/10％FBS 100 μl（0.02μM）+900μlRPMI/10％FBS等。

使用12-多通道移液管和bassin从底部（最低浓度）开始至顶部（最高浓度），从96-V-底板的每孔中移取100μl2×浓缩肽溶液。这将避免每次更改提示。

对于对照，对于每个T细胞，以最高浓度（2μM）制备一种不含肽的溶液和一种具有不相关肽（例如I类Flu特异性肽）的溶液克隆进行测试。

CD8 T细胞克隆（效应细胞）的制备
计算测试所需的单元格数：
对于每个T细胞克隆，对于不含肽和无关肽的对照，将需要10,000×2（重复）= 20,000×8稀释= 160,000个细胞和40,000个细胞，使得总共为0.2×10 6个 sup>细胞用于每个待测试的T细胞克隆
考虑体积损失，制备0.25×10 6个T细胞并将其重悬于1.25ml RT RPMI/10％FBS（0.2×10 6个细胞/ml）中。

向已经含有100μl系列肽稀释液的每个孔中加入50μl制备的效应细胞（= 10,000个细胞/孔）。

将样品装载在测定板中的步骤（图1） 1步骤：肽稀释液（100μl）（步骤A2）

2 <步骤：步骤：CD8T细胞克隆（10,000个细胞，50μl）（步骤A3）

3 步骤： 51 Cr标记的T2（1,000细胞，50μl）（步骤A1）

对照：自发释放（SR）：具有150μl培养基和50μl51 Cr-标记的T2的4个孔。总释放（TR）：4个孔，150μl的1M HCl和50μl的 51 Cr标记的T2。

当板填充时，在37℃下在具有5％CO 2的培养箱中孵育其4小时。

图1.将CTL测试样品装载到V-底96孔板中的步骤。步骤1：使用多通道移液管加载100μl的2x肽溶液，从低浓度（底部，浅蓝色）至高浓度（顶部，深蓝色）。步骤2：从底部到顶部单独添加50μl效应CD8 T细胞克隆（这里是克隆A和B）（黑点）。您可以每96孔板测试多达6个克隆。步骤3：使用多通道移液器将50μl新鲜的^{51 Cr标记的靶细胞加载到每个孔中。在实验的最后一个板中制备对照孔。避免接触井中存在的液体，同时引入测试的不同组分}
⁵¹ Cr放射性的测定
在4小时孵育结束时，以234×g离心板2分钟，并使用多通道移液管将50μl来自每个孔的上清液转移至LumaPlate-96。使用TopCount NXT读数器将存在于每种上清液中的由 Cr发射的辐射量确定为每分钟计数（CPM）。

计算特异性裂解：EC50和EMax
为了计算在每个孔中发生的特异性裂解的量，使用下式：100x [每分钟的实验计数（cpm）-SR（平均cpm）/（TR（平均cpm）-SR（平均cpm）裂解。
每个克隆的抗原敏感性和最大杀伤能力可以分别定量为EC 50和EMax。 EC 50由产生靶细胞的半数最大裂解的肽浓度定义，并且可以通过使用例如Prism软件拟合剂量反应曲线分析来得到（图2）。 EMax定义为效应T细胞的相对最大裂解能力（图2）

图2.通过测量用梯度浓度脉冲的T2靶细胞的裂解能力评估表达不同αβTCR的5种NY-ESO-1 157-165-反应性CD8 T细胞克隆的相对功能亲合力的天然NY-ESO-1 157-165肽（SLLMWITQC）。还显示了EC50的实例（即对于产生最高最大裂解（黑色圆形）的克隆，最大裂解（最大裂解的50％）和最大裂解（即，高（饱和）抗原剂量的最大裂解）。细节可以在Hebeisen 等人。，2015年找到。}
肿瘤杀伤（TK）用肿瘤靶细胞滴定测试
以下部分描述了进行肿瘤杀伤（TK）测定所需的不同步骤：用^{51 Cr放射性标记肿瘤靶细胞（步骤B1）。效应CD8 T细胞的制备（步骤B2）。肽溶液的制备（步骤B3）。将装载程序装入96孔板（步骤B4）。测定 Cr放射性（步骤B5）。分析结果（步骤B6）。
用⁵¹ Cr放射性标记肿瘤细胞系计算TK测定所需的靶细胞（例如，黑素瘤细胞系Me275）的数目。对于96孔板的1个孔，需要1,000个靶细胞。考虑增加20％的细胞以解决移液期间的体积损失。
注意：我们通常会标记0.5 x 10 ⁶ 目标单元格，足以容纳500个井。 >
在15ml Falcon管中收获正确数目的肿瘤靶细胞，并在室温（RT）下以530×g离心5分钟。

在1ml RT RPMI/10％FBS培养基中洗涤细胞。

旋转，除去所有液体，并在50℃的水浴中用50μl的纯的51 Cr溶液（活性为1mCi/ml）孵育肿瘤细胞45分钟。

在^{51 Cr标记后，加入10ml的RPMI/10％FBS并在530×g下旋转5分钟。按照所需的安全预防措施丢弃上清液（请联系您的无线电安全官员了解详细步骤）}
用10ml RPMI/10％FBS再重复洗涤步骤两次。

在第三次洗涤后，以0.02×10 6个/ml的浓度在RT中重悬细胞 RPMI/10％FBS
在96-V底板的每个孔中的最后一步（见步骤B4）加入50μl（1,000细胞）的该细胞溶液。

T细胞克隆的制备对于一式两份进行的肿瘤杀伤测定，每个克隆需要0.1×10 6个T细胞。如果测试包括在目标上具有和不具有肽脉冲的条件（参见步骤B4），则需要至少0.2×10 6个 T细胞。
计数CD8 T细胞克隆，并以0.6×10 6个/ml的浓度在RT RPMI/10％FBS中重悬。

从该溶液中，如下直接在96-V底板中制备连续稀释液：
在第一个条件[效应器（E）到目标（T）比例30：1]的第一个孔中加入75μl（45,000个细胞）和50μl的RPMI/10％FBS，位于底部的三个孔中。记住对重复项做两次。继续转移25微升的第一个井在第二个，通过吸移上下混合井，并同样进行连续稀释。最后，所有孔含有50μl含有括号中所示细胞数的培养基。
注意：多通道移液器可用于快速处理整个96孔板。

肽溶液
在RPMI/10％FBS培养基中稀释肽储备溶液（1mM）以制备2x浓缩的2μM溶液。使用肽的每孔终浓度为1μM。例如，将10μl肽储备溶液（1 mM）放入5 ml RPMI/10％FBS（足够500次测试）。

在适当的孔中加入100μlRPMI/10％FBS（无肽条件）或100μl2倍浓缩肽溶液。
注意：每96孔板，我们在顶部4行（A至D）中制备"无肽"条件，在4条底部行（E至H）中制备"+肽"条件。

在测定板中装载样品的步骤（图3）
1 步骤：CD8 T细胞克隆系列稀释（50μl）（步骤B2）

2 <步骤：步骤：具有或不具有肽（100μl）的溶液（步骤B3）

3步骤：将51 Cr标记的Me275（1,000细胞，在50μl中）（步骤B1）

对照：自发释放（SR）：用150μl培养基和50μl51 Cr标记的T2充满4孔。总释放（TR）：用150μl1M HCl和50μl sup> 51 Cr标记的T2

当板被填充时，在37℃下在具有5％CO 2的培养箱中孵育测试样品4小时。

图3.将TK测试样品加载到V-底96孔板中的步骤。步骤1：进行CD8 T细胞克隆的连续稀释，以在每个孔中获得50μl细胞。对于每个克隆（此处为A和B），在有或无肽的两种条件下再生系列稀释液。步骤2：使用多通道移液器，在板的相应的一半中加入100μl的2x肽溶液（红色）或培养基（蓝色）。步骤3：使用多通道移液器将50μl新鲜的^{51 Cr标记的靶细胞加载到每个孔中。在实验的最后一个板中制备对照孔。避免接触井中存在的液体，同时引入测试的不同组分}
⁵¹ Cr放射性的测定
在4小时孵育结束时，以234×g离心板2分钟，并使用多通道移液管将50μl来自每个孔的上清液转移至LumaPlate-96。使用TopCount NXT读数器，将存在于每种上清液中的由 Cr发射的辐射量确定为每分钟计数（CPM）。
计算特异性裂解
为了计算在每个孔中发生的特异性裂解的量，使用下式：100x [（每分钟的实验计数（cpm）-SR（平均cpm）/（TR（平均cpm）-SR（平均cpm）特异性裂解效应CD8 T细胞识别和裂解肿瘤细胞在不同的效应物靶目标比率的功效可以表示如图4所示使用Prism软件。

图4.使用黑色素瘤细胞系Me275（A2 sup-1）评估表达不同αβTCR的5种NY-ESO-1 157-165-反应性CD8 T细胞克隆的相对肿瘤细胞裂解能力。 pos /NY-ESO-1 _157-165 ^pos）。详情请参阅Hebeisen et al 。，2015.}

笔记

使效应细胞和靶细胞处于非常好的条件是非常重要的（Rubio-Godoy等人，2001）。效应细胞应该处于休眠期（在再次刺激后的D12-D16周围），以避免高度非特异性背景杀伤。靶细胞处于不良状态（死亡或死亡）不能用铬有效标记，这导致难以解释的结果。
每个新的未知靶细胞应首先测试其用铬标记的能力（仅4小时自发和完全释放）。

致谢

这项工作得到了洛桑大学肿瘤学系和洛桑大学癌症研究中心的支持。
铬释放测定由瑞士实验癌症研究所（ISREC）和洛桑大学生物化学系（瑞士）的研究人员开发，并于1968年首次出版（见参考文献1）。

参考文献

Brunner，KT，Mauel，J.，Cerottini，JC and Chapuis，B.（1968）。免疫淋巴细胞对51-Cr标记的同种异体靶细胞的体外溶解作用的定量测定等同抗体和药物的抑制。 Immunology 14（2）：181-196。

Hebeisen，M.，Schmidt，J.，Guillaume，P.，Baumgaertner，P.，Speiser，DE，Luescher，I. and Rufer，N.（2015）。通过单体TCR-标记的罕见高亲和力，肿瘤反应性CD8 + T细胞的鉴定，对活细胞的配体解离速率测量。 Cancer Res 75（10）：1983-1991。

Rubio-Godoy，V.，Dutoit，V.，Rimoldi，D.，Lienard，D.，Lejeune，F.，Speiser，D.，Guillaume，P.，Cerottini，JC，Romero，P.and Valmori，（2001）。 ELISPOT干扰素-γ分泌与A2 /肽多聚体与TCR的结合揭示了CTL效应子功能与TCR-肽/MHC复合物半衰期的克隆间解离。 Proc Natl Acad Sci USA 98（18）：10302-10307 。

Speiser，DE，Baumgaertner，P.，Voelter，V.，Devevre，E.，Barbey，C.，Rufer，N。和Romero，P.（2008）。未修饰的自身抗原触发具有比改变的抗原更强的肿瘤反应性的人类CD8 T细胞。 Acad Sci USA 105（10）：3849-3854。

Zippelius，A.，Pittet MJ，Batard P.，Rufer N.，de Smedt M.，Guillaume P.，Ellefsen K.，Valmori D.，LiénardD.，Plum J.，MacDonald HR，Speiser DE，Cerottini JC and Romero P.（2002）。胸腺选择产生大 T cell pool recognition a self-peptide in humans.Vermat J Exp Med 199（4）：485-94。