材料和试剂

12mm圆形玻璃盖玻片（Fisher Scientific，目录号：12-545-80）
24孔板（Corning，Falcon ，目录号：351147）
无菌SealPlate ^®盖（Excel Scientific）
PC12细胞（ATCC，目录号：CRL-1721）
小鼠层粘连蛋白（Corning，目录号：354239）
100％乙醇
聚赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P5899）
RPMI 1640（Corning，目录号：10-041-CV）
马血清（Corning，目录号：35-030-CV）
胎牛血清（FBS）（Fisher Scientific，目录号：SH3007003IH）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Corning，目录号：10-013-CV）
小牛血清（GE Healthcare Life Sciences，Hyclone ^TM，目录号：SH30072.03）
神经生长因子（NGF）（Corning，目录号：356004）
球形1.77克/厘米3 环三亚甲基三硝胺5类（RDX Class V）费用
HEPES（Fisher Scientific，目录号：BP299500）
10加仑聚（甲基丙烯酸甲酯）（PMMA）
Calcein-AM（Thermo Fisher Scientific，目录号：C3099）
乙锭同型二聚体-1（Thermo Fisher Scientific，目录号：E1169）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Fisher Scientific，目录号：BP399500）
乳酸脱氢酶细胞毒性测定试剂盒（LDH）（Abnova，目录号：KA0785）
RIPA缓冲液（Alfa Aesar，目录号：J62189-AP）
蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
微BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：23235）
Hank's平衡盐溶液（HBSS）（Corning，目录号：21-022-CV）
Calcein（MP Biomedicals，目录号：190167）
青霉素/链霉素，50x（Corning，目录号：30-001-Cl）
抗生素/抗真菌剂（见配方）
生长/完全培养基（见配方）
分化介质（参见配方）

设备

孵化器
水族馆
三个压电高频动态压力传感器（PCB Piezotronics，型号：102A）
无菌罩
烤箱
Zeiss LSM5 Pascal配备了Epiplan-Neofluar镜头
共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）

软件

ImageJ v 1.34
蔡司LSM软件（v 4.2.0.121）

程序

实验设置和准备
1. 细胞样品制备
  1. 使用piranha蚀刻清洁12mm圆形玻璃盖玻片[H 2 SO 4：H 2 O 2 2 = 70： 30（v/v）] 30分钟，然后用去离子（DI）水彻底冲洗
  2. 超声处理幻灯片10分钟/次，在100％乙醇中消毒3次
  3. 将无菌盖玻片置于24孔板中，并在100μg/ml无菌聚赖氨酸溶液中包被30分钟。
  4. 在无菌去离子水中冲洗载玻片三次，并使其风干
  5. 将载玻片在10μg/ml无菌层粘连蛋白中在4℃下孵育过夜
  6. 蛋白质附着后，用无菌PBS冲洗载玻片三次，并立即用于细胞培养
  7. 在37℃和5％CO 2下，在补充有10％热灭活的马血清和5％胎牛血清和1％抗生素/抗真菌"完全培养基"的RPMI 1640培养基中培养细胞。根据供应商的说明培养细胞。
  8. 在具有1％马血清，0.5％小牛血清和1％抗生素/抗真菌"分化培养基"的高葡萄糖DMEM中的24孔板中的12mm盖玻片上以5,000细胞/孔的密度种细胞。
  9. 24小时后，向分化培养基中加入100ng/ml NGF。使细胞在加入NGF后5天进行blast。
2. 爆炸诱导的损伤体外设置
3. 爆炸引起的细胞损伤
  1. 恰好在无菌罩中的爆炸实验之前，在无菌罩中移除塑料孔板盖，并在孔板中加入无菌HEPES缓冲液（10mM）。用无菌SealPlate盖密封孔板。置于塑料袋中以保持培养物的无菌性。将样品运送到爆炸现场，并将样品放在37℃的烘箱中直到实验
  2. 将样品水平浸没在装有加热至37℃的水的10加仑聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）水族箱中的样品保持台上，如图2所示。
  3. 在水下水平安装，固定和浸没神经元细胞系培养孔板在水族箱的中间，其中第一排（1）的细胞面向休克前沿。
  4. 所有爆炸实验均在没有孔板盖的情况下进行
  5. 在实验期间将对照样品放入培养箱中。
  6. 将假细胞在水族箱中20分钟（三重爆炸实验的典型长度）。
  注意：对照样品和假样品不相同。对照样品保留在实验室的培养箱中，同时将运送到喷丸位点的假样品浸没在水族箱中并在喷射实验期间保持在烘箱（无CO 2）中。/em>
4. 在胚细胞暴露期间的压力测量（图5）
  使细胞在补充有100ng/ml NGF的分化培养基中接种细胞5天后进行单次或多次blast攻击。为了最小化运动，确保细胞与盖玻片的良好附着。此外，需要仔细选择孔板和盖玻片的尺寸，使得盖玻片紧密地配合在孔内。
  
  图5.乳腺诱导的细胞损伤 A.显示铅笔量的水族箱。 B.样品孔板浸没在水族箱中，显示盖子上压力传感器的位置
细胞分析
1. 细胞形态学和生存力分析
  对于单爆炸暴露，根据Life Technologies ^{TM概述的方案，通过用钙黄绿素-AM和乙锭同型二聚体-1染色细胞来评估胚细胞后2和24小时的细胞活力。简而言之，取出培养基并用PBS冲洗细胞三次。
  
  将细胞在含有2μM钙黄绿素-AM和4μM乙锭同型二聚体-1的PBS溶液中在37℃下孵育30分钟。
  
  使用543nm和488nm激光用于生存力测定：通过共聚焦激光扫描显微术（CLSM）在配备有Epiplan-Neofluar透镜的Zeiss LSM5 Pascal上的图像样品。使用543nm激光器以多道模式对单元格进行成像，使用10x和20x物镜，最少3个重复样本中的每个最小n = 5个随机区域。
  
  CLSM使用ImageJ v 1.34中的图像区域分析工具进行处理，National Institutes of Health。将图像转换为二进制和为每个通道设置的阈值（活细胞和死细胞）
  使用分析粒子工具计算面积百分比。
  
  通过将死细胞面积的百分比乘以平均活细胞大小/平均死细胞大小来校正死细胞与活细胞相比的更小的细胞大小。
  
  通过取活细胞百分比面积占总活率和校正死细胞百分比面积计算活细胞百分比。
  
  通过钙黄绿素AM染色评估神经突形态（图6）
  使用Zeiss LSM软件测量长度和珠粒直径。
  
  图6.暴露于单个和多个爆炸性爆炸物后24小时的PC12神经元的活力。 32psi。 I：具有活/死染色的CSLM图像。（A）一次爆炸，（B）两次爆炸，（C）三次爆炸。箭头表示选择的死细胞。插图：死细胞的放大图像。 II。活力定量。 * P 0.05与对照，假手术和单爆炸相比。在A-C中比例尺=100μm; 插图为}
2. 膜渗透性测定
  1. 在爆发后1,2,4和24小时从细胞外浴中取样培养基
  2. 根据制造商的说明进行LDH测定
  3. 取出介质，用PBS冲洗样品，并擦拭盖玻片几分钟
  4. 向每个盖玻片中加入约20μl含有1％（vol）蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液
  5. 立即刮取细胞，使用Micro BCA方案分析或放在冰上30分钟，然后储存在-80℃直到分析。
  6. 将所有值归一化为从微BCA蛋白测定确定的总蛋白
  7. 通过用HBSS（无钙和镁）冲洗样品，然后在0.3mM钙蛋白的HBSS中孵育10分钟来探测钙黄绿素摄取。
  8. 用HBSS彻底冲洗样品，使用CLSM系统上的488 nm激光进行成像。
  9. 修正成像增益和偏移量，以便在样本之间进行半定量比较。
  10. 收集相位对比图像，以确保单元格在焦点。
  11. 通过使用感兴趣区域（ROI）特征选择单个细胞并使用软件使用直方图特征计算平均强度来测量荧光强度（图7）。
  图7.作为钙黄绿素染料摄取的PC12神经元的暴露于爆炸性爆炸的膜渗透性变化。 32 psi。 * P 0.05与对照组和假手术组相比，n = 3

食谱

抗生素/抗真菌剂
10,000 IU青霉素
10,000μg/ml链霉素 25μg/ml两性霉素
生长/完全培养基
高葡萄糖DMEM
10％热灭活的马血清
5％胎牛血清 1％抗生素/抗真菌剂
分化媒介
高葡萄糖DMEM
1％马血清
0.5％小牛血清
1％抗生素/抗真菌剂
100 ng/ml NGF

致谢

这项研究由美国陆军研究实验室主任的科学计划，DSI-13-WMR-2D-005支持。

参考文献

Zander，NE，Piehler，T.，Boggs，ME，Banton，R.and Benjamin，R。（2015）。体外对原发性爆炸负荷对神经元的研究。 J Neurosci Res 93（9）：1353-1363。