材料和试剂

27号针（TERUMO，目录号：NN-2719S）
1ml注射器（TERUMO，目录号：SS-01T）
6孔板（Coring，Falcon ，目录号：353046）
50ml管
70μm细胞过滤器（Coring，Falcon ，目录号：352350）
10ml注射器（TERUMO，目录号：SS-10SZ）
小鼠（成人> 6周，任何性别，任何应变）
透明质酸酶（60mg/ml储液）（Sigma-Aldrich，目录号：H3506）
胶原酶VIII型（10mg/ml储液）（Sigma-Aldrich，目录号：C2139）
RPMI 1640（Sigma-Aldrich，目录号：R8758）
胎牛血清，热灭活（Biowest，目录号：S1820-500）
HANK的解决方案"Nissui"②（NISSUI PHARMACEUTICAL，目录号：05906）
NaHCO 3（NAKARAI TESQUE，目录号：31212-25）
NaN 3（NAKARAI TESQUE，目录号：31208-82）
消化介质（参见配方）
FACS解决方案（参见配方）

设备

外科剪刀和镊子
Mini-shaker 3D（Biosan，目录号：BS-010151-AAK）
冷冻离心机

程序

安乐死小鼠。用70％乙醇消毒小鼠皮肤，并用剪刀和镊子剥离踝关节的皮肤（图1）。小心不要留下任何皮肤。

图1.剥离踝关节的皮肤
使用剪刀剪断踝关节上方0.7厘米处的腿，并丢弃手指部分（图2）。

图2.剪下脚踝
在2ml RPMI 1640中洗踝部分。
使用填充有RPMI 1640的27号针和1ml注射器冲洗骨髓细胞，并丢弃骨髓细胞。
将骨髓移除的踝关节置于6 ml板的4 ml消化培养基中（图3）。

图3.将脚踝置于消化介质
用剪刀将脚踝剪成3-4毫米大小的块（图4）。

图4.剪断踝关节
在6孔板中温育脚踝，在37℃，5％CO 2下，通过Mini-shaker轻轻摇动1小时。
将细胞过滤器置于50ml管中。然后，将消化踝关节的介质转移到细胞滤网上
从10ml注射器中取出柱塞。使用柱塞的黑色橡胶端将踝部残留物捣碎。
加入10ml 10％FBS/RPMI 1640.
在4℃下以1,500rpm（400×g）离心5分钟
弃去上清液，并在FACS溶液中重悬细胞沉淀
计数活细胞。代表性数据如下所示（图5）。
执行FACS分析。代表性数据如下所示（图6）。

代表数据

图5.踝关节中的细胞数。显示通过该方案获得的总细胞数（A）和T细胞数（B）。白色菱形代表来自WT小鼠的非发炎踝的细胞，黑色菱形代表来自Illrn -/- 小鼠中发炎踝的细胞（Akitsu， al 。，2015）。每个符号表示无冲洗的关节细胞数（步骤4）[冲洗（ - ）]，去除骨髓的关节细胞[（冲洗（+）]和骨髓细胞>

图6.来自发炎踝关节浸润的细胞的FACS分析的实例来自II1rn ^-/- 的关节浸润细胞的流式细胞术。小鼠（Akitsu，et al。，2015）。数字表示每个门中的单元格百分比。数据代表10次独立实验。

笔记

通过使用该方案的十次独立实验获得类似的数据
如果关节炎是关节炎与炎症，来自小鼠的关节细胞足以用FACS分析。但是，对于正常关节，推荐使用两到四只小鼠的水池。
从关节炎小鼠，从一只小鼠获得2-4×10 4个T细胞（不冲洗步骤）。因为骨髓来源的细胞是总T细胞的约1/5，所以可以跳过冲洗步骤。另一方面，没有冲洗步骤的总细胞数为约4×10 6个细胞/非发炎踝和7-13×10 6个细胞/发炎踝。因为1/2-1/3来源于骨髓，所以需要冲洗步骤来分析非T细胞群体。在冲洗步骤后，全部关节浸润的细胞数在非发炎踝关节中为约2×10 6个细胞，在发炎的踝关节中为约5-7×10 6个细胞。

食谱

消化介质
160μl透明质酸酶（终浓度：2.4mg/ml） 400μl胶原酶VIII（终浓度：1mg/ml） 4ml补充有10％FBS的RPMI 1640
FACS解决方案
将4.9g HANK溶解在490ml H 2 O中加入0.15g NaHCO 3和0.05g NaN 3，并完全溶解
加入10ml灭活的FBS（最终2％），然后混合
在4°C储存，直到使用

致谢

这项工作得到了日本教育，文化，体育，科学和技术部的助学金的支持。

参考文献

Akitsu，A.，Ishigame，H.，Kakuta，S.，Chung，SH，Ikeda，S.，Shimizu，K.，Kubo，S.，Liu，Y.，Umemura，M.，Matsuzaki，G.，Yoshikai ，Y.，Saijo，S。和Iwakura，Y。（2015）。 6：7464。