材料和试剂

24孔板（Sigma-Aldrich，目录号：Z707791-126EA）
13mm圆形盖玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：174950）
玻璃滑槽
过滤器（0.2μm）
过滤单元（Merck Millipore，目录号：SCGPS05RE）
人胚胎干细胞（H9，WIBR2和HUES1）和癌细胞（TCCSUP和RT112）
Matrigel
PBS溶液（Life Technologies）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：SO389）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
PIPES（Sigma-Aldrich，目录号：P6757）
NaOH
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
核糖核苷氧钒基复合物（New England Biolabs，目录号：S1402）
多聚甲醛（PFA）（16％，EM级）（VWR International，目录号：100503-916）
EtOH
人类Cot-1 DNA（Life Technologies）
无水乙酸钠（NaOAc）（Sigma-Aldrich，目录号：W302406）
去离子甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：F9037）
橡胶水泥
20x SSC（Sigma-Aldrich，目录号：93017）
20 mg/ml BSA（New England Biolabs，目录号：B9000S）
硫酸葡聚糖（Sigma-Aldrich，目录号：67578）
甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：47670）
安装介质（Vector Laboratories，目录号：H-1200）
Cy3标记的人X染色体涂料（Metasystem，目录号：D-0323-050-OR）
FITC标记的人X染色体涂料（Metasystem，目录号：D-0323-050-FI）
CSK缓冲区（请参阅配方）
3％PFA/PBS溶液（参见配方）
杂交缓冲液（2x）（参见配方）
洗涤溶液（50％甲酰胺/2×SSC）（参见配方）
变性溶液（70％甲酰胺/2×SSC）（参见配方）

设备

杂交表（Boekel Scientific，型号：240000）
Shake'N Bake ^TM杂交炉（Boekel Scientific，型号：136400）
离心机（VWR，Ependorf ，型号：5417R）
Millivac-mini真空泵（Merck Millipore，目录号：XF5423050）
Ependorf Thermomixer R（Sigma-Aldrich，目录号：T3317）
注意：此产品已停产。
荧光显微镜（机动载物台）（Leica，型号：DMI-6000）

程序

准备24孔板与13毫米圆盖玻片在底部的孔。用人胚胎干细胞的基质胶涂盖玻片。在盖玻片上以1:5的比例在菌落中分裂细胞。生长细胞24至48小时
用每孔1ml PBS洗涤细胞
在冰上孵育细胞5分钟，每孔0.5ml每孔新鲜补充0.5％Triton X-100和2mM氧钒核糖核苷复合物的冰冷的CSK缓冲液。核心CSK缓冲液可以在几个月内保持在4°C
修复细胞在室温下10分钟，用0.5毫升每孔的PBS/3％PFA补充2mM氧钒核糖核苷复合物。
用1ml /孔冲洗细胞3次，用冷的EtOH（70％）4分钟
可以进行到步骤8或者可以通过用石蜡膜紧紧包裹24孔板，轻轻地拉伸以确保良好的配合和避免蒸发来停止方案。细胞可以在-20℃保存一个月。
在实验当天，将盖玻片在70％EtOH中加热至4℃
对于探针制备，对于每个盖玻片，向5μl浓缩染色体涂料和5μl人Cot-1 DNA（1μl/μg）中加入290μl水。通过加入1/10 3 M NaOAc和2.5体积的100％EtOH沉淀DNA，并在-20℃下储存管过夜。每个盖玻片单独制备探针：1混合1盖玻片
在4℃下以15,000×g离心20分钟旋转探针。沉淀应该是可见的并且用70％EtOH洗涤2次并在4℃下以15,000×g离心10分钟。
将沉淀重悬于5μl50％去离子甲酰胺/50％杂交缓冲液（2x）中，并在37℃孵育10分钟。
在75°C将染色体涂料变性7分钟，在37°C孵育30分钟，并储存在冰上。
同时，脱水盖玻片在90％和100％乙醇中各4分钟。然后将盖玻片在Kimwipes上风干，细胞面朝上。在37℃下，在杂交台上热清洁玻璃载玻片，其中护城河已经预装水。
每个盖玻片分配5微升探针在玻片上，并将盖玻片放置在探针上，细胞面朝下（图1）。孵育盖玻片在37℃过夜，并使用橡胶水泥密封盖玻片到玻璃载玻片防止盖玻片周围的蒸发。

图1.操作盖玻片。A.将5μl探针放在载玻片上。 B.将具有细胞的盖玻片面向下放置在探针制备上
第二天，通过轻轻地从盖玻片上取下橡胶水泥。溢出2毫升2x SSC盖玻片和玻璃幻灯片，轻轻开始推动盖玻片，通过使它们在2x SSC浮动。完全分离的盖玻片被转移到24孔板用于进一步的洗涤。用1％每孔的50％甲酰胺/2×SSC洗涤盖玻片3次，在2x SSC中洗涤3次，全部在42℃洗涤。在具有低搅拌（振荡器速度设定为中等速度）的杂交烘箱中孵育具有盖玻片的24孔板。
使用5μl包含DAPI的封装介质在玻璃面上盖玻片。使用透明指甲油密封幻灯片上的盖玻片
用荧光显微镜观察荧光信号（放大100倍）。

对于涉及染色体涂层的双重RNA-FISH（Vallot等人，2015）
1. RNA-FISH在两个步骤中进行。首先，如上所述，用染色体涂料进行RNA-FISH过夜（步骤1-14）。
2. 将盖玻片在37℃下在50％甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，并用第二探针再温育过夜。
3. 盖玻片在50％甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，在2×SSC中在37℃下洗涤3次。同时观察这两个信号。
对于具有染色体涂层的连续RNA/DNA-FISH（Vallot等人，2015）

如上所述使用Cy3标记的涂料在载玻片上进行RNA-FISH以显现RNA，使用阶段摩托化的徕卡显微镜拍摄照片和注意细胞坐标。
洗涤载玻片，将细胞在0.1N HCl/0.7％Triton X-100中在冰上透化10分钟，用100μg/μlRNA酶在2x SSC中在37℃处理1小时。< br />
变性在80℃在70％甲酰胺/2×SSC中滑动10分钟
使用FITC标记的X染色体涂料使DNA可视化，在75℃变性2分钟，并与载玻片一起温育。
用45℃的2x SSC和60℃的0.1×SSC洗涤载玻片3次。

代表数据

图2.优化X染色体RNA RNA FISH。在过夜杂交之前，将5μl的cy3-X染色体涂料与各种量的人Cot-1 DNA共沉淀。当更换染色体涂料的供应商时，应该优化Cot-1的数量

图3.癌细胞中X染色体活性的单细胞检测通过DNA-FISH使用FITC评估两个膀胱癌细胞系RT112（A）和TCCSUP（B）的X染色体含量标记的X染色体涂料（左图）和通过RNA涂料的X-染色体活性使用cy3标记的X-染色体涂料（右图）。右下角的百分比表示具有显示图案的细胞核的百分比。

食谱

CSK缓冲区
100 mM NaCl
300mM蔗糖 3mM MgCl 2/
10 mM PIPES
用NaOH调节pH至6.8，以促进化学物质在水中溶解
过滤器（0.2μm）
3％PFA/PBS溶液
9.4ml 16％PFA溶液
40.6ml PBS
杂交缓冲液（2x）
4x SSC
4mg/ml BSA
20％硫酸葡聚糖
40mM氧钒核糖核苷复合物
洗涤溶液（50％甲酰胺/2×SSC）（50ml），pH = 7.2 25ml甲酰胺 5ml 20×SSC
20ml H 2 O 2 / 60μl2.5N HCl
变性溶液（70％甲酰胺/2×SSC）（50ml），pH = 7.2 35ml甲酰胺 5ml 20×SSC
10ml H 2 O x/v 145μl2.5N HCl

致谢

我们感谢我们实验室的成员激发讨论。导致这些结果的研究得到欧洲研究委员会根据欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013）/ERC赠款协议n°206875和Inserm（Avenir计划R0721HS）的资助。

参考文献

Vallot，C.，Ouimette，JF，Makhlouf，M.，Feraud，O.，Pontis，J.，Come，J.，Martinat，C.，Bennaceur-Griscelli，A.，Lalande，M.and Rougeulle，（2015）。人类多潜能细胞中X染色体失活的侵蚀起始于XACT涂层，取决于特异性异染色质。细胞干细胞 16（5）：533-546。