材料和试剂

膜透析管Spectra/Por 6预润湿，1.1ml/cm 3,500Da截留（Spectrum，Spectra/Por ，目录号：132590）
膜透析管Spectra/Por 6预润湿，1.1ml/cm 10,000Da截留（Spectrum，Spectra/Por ，目录号：128118）
具有Ultracel-3膜的Amicon超离心过滤器单元（Merck Millpore，目录号：UFC900308）
具有Ultracel-10膜（Merck Millpore，目录号：UFC901008）的Amicon Ultra-15离心过滤器单元
具有Ultracel-3膜的Amicon超离心过滤器单元（Merck Millpore，目录号：UFC800324）
具有Ultracel-10膜的Amicon超离心过滤器单元（Merck Millpore，目录号：UFC801024）
EasyXtal 15孔工具（Qiagen，目录号：132006）
0.22μm过滤器
96孔板
SS34离心管
大肠杆菌（大肠杆菌）Bl21（DE3）（储存于-80℃）
pTRX-Sxl和pTRX-CSD质粒（根据要求提供）
烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶（1mg/ml储备溶液，内部生产）
精密加蛋白全蓝色预染蛋白标准品（Bio-Rad，目录号：1610373）
LB培养基
卡那霉素（33mg/ml储备溶液，储存于-20℃）
异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）（1M储备溶液）
Ni-NTA树脂（Qiagen，目录号：30230）
磷酸钠（分子生物学级）
氯化钠（分子生物学级）
磷酸钾（分子生物学级）
咪唑（分子生物学级，> 99％）
β-巯基乙醇
叠氮化钠
硫酸铵（分子生物学级，> 99％纯度）
基于msl2 mRNA的E片段的18聚体RNA：UUU UUU UGA GCA CGU GAA（合成的）（IBA）（UniProt Consortium，目录号：P50534）
硫酸锂（X射线晶体级，> 99％纯度）
PEG 3350（Sigma-Aldrich，目录号：39713）
二硫苏糖醇（DTT）（> 99％纯度）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：49767）
裂解缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液A（参见配方）
洗涤缓冲液B（参见配方）
洗脱缓冲液（参见配方）
NMR缓冲液（参见配方）
运行缓冲区（参见配方）

设备

锥形烧瓶（500ml）
FPLC蛋白纯化器
Superdex S75凝胶过滤分子排阻色谱柱HiLoad 26/600（GE Healthcare）
纳米系统

程序

表达Sxl和Unr
1. pTRX-Sxland和pTRX-CSD质粒[基于pETM11表达载体]，包括Sxl的RRM1-RRM2的核苷酸序列，对应于D的残基123-294。 melanogaster Sxl，UniProt entry：P19339，和Unr的第一个冷休克结构域（CSD1），对应于D的残基181-252。 melanogaster Unr，UniProt entry：Q9VSK3。两种质粒都具有N末端His 6标记的硫氧还蛋白溶解度标签，连接到具有TEV-切割位点的Sxlor（参见图1）]转化到大肠杆菌中菌株B121（DE3），在42℃下使用热休克2分钟。表达是有效的，并且可能其他表达菌株也将工作。此外，两种构建体的表达是高度可重复的。每次需要更多的蛋白质时，都会进行一次新的转化
2. 对于大规模蛋白质生产，用每个转化板（Sx1和Unr）的单个菌落接种具有33μg/ml卡那霉素的50ml LB培养基的一个过夜培养物。将培养物在37℃和220rpm下孵育约16小时
3. 然后，将具有33μg/ml卡那霉素的1L LB培养基分成两个2L锥形瓶（每个500ml），接种2ml过夜培养物（比例1:250），并进一步在37℃和220℃温育rpm。
4. 当达到0.8-1（约3-4小时）后的光密度（OD 600nm）时，通过加入IPTG至终浓度为1mM诱导蛋白质产生。诱导后，将培养物在20℃和220rpm温育16小时
5. 然后在4℃以3000×g收获细胞30分钟。
6. 将细胞沉淀重悬浮于45ml裂解缓冲液中并转移到50ml管中，然后在冰上超声处理5分钟（1秒间隔，微尖）。
7. 通过在5,000x g和4℃下离心30分钟使细胞碎片沉淀。
8. 在纯化之前，将含有过表达的Sxl或Unr的上清液通过0.22μm过滤器过滤
  
  图1.本协议中使用的Sxl和Unr构建体。表示根据其天然序列的氨基酸数字（Q，富含谷氨酰胺的结构域）。
Sxl和Unr-CSD1的纯化
1. 纯化Sxl
2. 纯化的Unr-CSD1
组装和纯化三元Sxl-Unrmsm12 mRNA复合物
1. 用NMR缓冲液将Sx1和Unr-CSD1溶液稀释至约20μM，并混合至等摩尔比（观察到较高浓度>100μM沉淀）。
2. 然后以1:1.1过量（蛋白质：RNA）加入18-mer RNA（参见材料和试剂）。复杂组装的顺序是重要的，因为没有Unr-CSD1的Sxl在加入长于10个核苷酸的RNA时倾向于沉淀。
3. 然后使用3kDa截留浓缩器将复合溶液浓缩至3ml的体积
4. 使用SuperdexS75 HiLoad 26/600凝胶过滤柱在运行缓冲液中使用尺寸排阻色谱以除去可能过量的单一组分。使用直角光散射来评估复合物的分子量（参见图4）。所有步骤均可在室温下进行，但离心分离应在4℃下进行，以避免样品加热和沉淀。
  
  图4.Sxl-Unr-CSD-msl2 mRNA三元复合物的FPLC-RALS色谱图。折射率（RI）显示为红色线，右边 - 角光散射值（RALS）显示为绿色线。从该数据，计算出复合物的分子量为36kDa
5. 合并含有复合物的级分，加入10mM DTT
6. 使用3kDa截留浓缩器将合并的级分浓缩至15mg/ml（450μM）的浓度。
注意：
a。使用在Nanodrop系统上的280nm波长的吸光度进行浓度测定，并计算消光系数。 Unr-CSD1的色氨酸缺乏使得浓度测定不准确。
b。所有凝胶过滤和离心步骤在4℃下进行。所有其它步骤，包括Ni-NTA纯化和组分的混合，在室温下进行。中间产物可以在4℃下储存。我们建议避免冻结，因为我们观察到解冻后等温滴定量热曲线的微小变化，我们没有解释。虽然两种蛋白质都被认为是稳定的，但是应避免在样品制备过程中更长的时间。
三元Sxl-Unr-msl2 mRNA复合物的结晶
1. 使用悬滴结晶来使络合物结晶。通过将2μl来自步骤C6的复合物溶液吸移到结晶井的盖子的内部来建立液滴，然后小心地将2μl储存溶液移至第一滴，不混合！
2. 储库溶液优化为0.1M LiSO 4和1％PEG 3350（w/v），其中500μl移液到孔中。
3. 然后将板在4℃下储存
4. 微小的晶体仅在两个月后出现，并且它们需要另一个月来生长至图5所示的最终尺寸。值得注意的是，缓慢的生长可能是由于DTT的存在，因为在Unr-CSD1的半胱氨酸之间形成复合物间二硫键，这对于结晶是重要的。由于DTT在4℃下氧化较慢，二硫键桥形成缓慢，并且密封悬滴很好。这是推测性的，但当没有使用DTT时，没有形成晶体
5. 作为用于储存的冷冻保护剂，使用30％甘油
  
  图5.从本方案中所述的结晶条件获得的晶体。图片中显示了两个水晶的尺寸以及比例尺。

食谱

裂解缓冲液
50mM磷酸钠 300 mM NaCl
pH 8.0
洗涤缓冲液A
50mM磷酸钠 300 mM NaCl
10mM咪唑 pH 8.0
洗涤缓冲液B
50mM磷酸钠 300 mM NaCl
20mM咪唑 pH 8.0
洗脱缓冲液
50mM磷酸钠 300 mM NaCl
120mM咪唑 pH 8.0
NMR缓冲液
10mM磷酸钾
50mM NaCl 10 mM DTT
pH 6.0
运行缓冲区
10mM磷酸钾
50mM NaCl pH 6.0

致谢

我们感谢马克斯·普朗克生物化学研究所的结晶设备，Martinsried的初始结晶筛选和Arie Geerlof的蛋白质表达和纯化。 J.H.承认来自瑞典研究委员会（Vetenskapsradet）和欧洲分子生物学组织（EMBO，ALTF276-2010）的博士后研究金。女士。承认德意志福寿司（DFG），授予SFB1035和GRK1721。

参考文献

Hennig，J.，Wang，I.，Sonntag，M.，Gabel，F。和Sattler，M。（2013）。在三元蛋白-RNA复合物的结构分析中组合NMR和小角度X射线和中子散射。< J Biomol NMR&/em> 56（1）：17-30。

Hennig，J.，Militti，C.，Popowicz，GM，Wang，I.，Sonntag，M.，Geerlof，A.，Gabel，F.，Gebauer，F.and Sattler，M.（2014） a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25209665"target ="_ blank"> Sxl-Unr翻译调节复合物的装配的结构基础。/a> 515（7526）：287-290。

Laemmli，UK（1970）。在结构蛋白噬菌体T4的头部的装配。
227（5259）：680-685。