材料和试剂

无菌培养皿（JET，目录号：TCD010090）
无菌滤纸（Sigma-Aldrich，目录号：Z241091）
种子：槿麻（cv Fuhong 992）[保存于福建农林大学作物遗传育种与利用重点实验室（中国）]。
无菌水（使用高压灭菌器在121℃/1大气压下灭菌20分钟）
无菌土壤（Fafard生长混合物1-PV/C-1PV，Sun Gro Horticulture Canada Ltd.）（使用高压灭菌器在121℃/1大气压下灭菌30分钟）
次氯酸钠（NaClO）溶液（15％）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：7681-52-9）
硝酸钾（KNO 3）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：7757-79-1）
二氢磷酸铵（NH 4 H H 2 PO 4）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：7722-76-1）
硝酸铵（NH 4 NO 3）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：6484-52-2）
硝酸钙[Sinopharm Chemical Reagent，目录号：13477-34-4）]的制备在室温下， br />
硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：10034-99-8）
乙二胺-N，N双（2-羟基苯基乙酸）铁钠复合物（Fe-EDDHA）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：16455-61-1）
硼酸（H 3 BO 3）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：10043-35-3）
氯化锰（MnCl 2·4H 2 O）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：7773-01-5）
硫酸锌（ZnSO 4·7H 2 O）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：7446-20-0）
硫酸铜（CuSO 4·5H 2 O）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：7758-98-7）
钼酸钠（Na 2 SO 4·MoO 4·2H 2 O）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：10102-40-6）
氯化钠（NaCl）（Sinopharm Chemical Reagent，目录号：7647-14-5）
PEG6000（Sigma-Aldrich，目录号：81260）
5％（v/v）次氯酸钠（参见配方）
Hoagland解决方案（参见配方）
200 mM氯化钠（NaCl）溶液（参见配方）
20％（w/v）PEG6000溶液（参见配方）

设备

塑料盆（直径10厘米，深8厘米）
洁净台（苏州航空科技，AirTech ^®，型号：SW-CJ-1FD）
生长室（上海益一益上海，Blue pard ，型号：MGC-300A）
高压灭菌器（TOMY，型号：SX-500）
精密平衡（±0.001）
定时器控制

程序

种子发芽和培养
1. 在流水下冲洗种子10分钟，然后用5％次氯酸钠消毒种子10分钟，然后用无菌水冲洗种子三次（图1A）。
2. 将无菌种子放在用无菌水饱和的滤纸上的培养皿中，并在28℃下将种子保持在完全黑暗中，直到发芽（约3天）（图1B和1C）。
3. 将3-5天的幼苗转移到无菌的土壤罐中
4. 将植物在28℃的生长室中在光下和26℃下保持8小时，无光，60％相对湿度，〜450μmol·m < - > 1 光强度，并且每天向土壤中补充100ml的1/4 Hoagland溶液（图1D）。
5. 允许植物长到3-10叶期（约4周），用于盐度和干旱处理测定
盐渍和干旱治理
1. 对于盐度处理，在Hoagland营养培养基中制备200mM氯化钠溶液，并且每天一次将100μl该溶液补充至10个盆中（图1D）。
2. 对于干旱处理，在Hoagland营养培养基中制备20％（w/v）PEG6000溶液，并且每天一次向10个盆中补充100ml该溶液（图1D）。
3. 在不同的时间点（例如6,12和24小时）从每株植物收获3处理的叶子。以与对照相同的间隔收集未处理的样品。从每次处理获得三个生物学重复（图1E）
  
  图1.实验步骤示例：A.在流水下冲洗种子; B.在培养皿中的饱和滤纸上灭菌的种子;发芽的种子;子叶期幼苗; E.收获叶片样品（约4周），如盐渍和干旱处理后的红色箭头所示

数据分析

分离RNA并用于实时PCR（RT-qPCR）的选择可靠参照基因（例如，ACT ，18S rRNA ，EF1α ）测定在盐度和干旱胁迫下，并且该部分在我们的论文中清楚地描述（Niu等人，2015）。

笔记

使用高压灭菌器将土壤在121℃/1atm下灭菌至少30分钟
聚乙二醇（PEG）是柔性的水溶性聚合物，并且其可以用于产生高渗透压。因此，它用于在植物中施加渗透压以引起水缺乏
应从每个样品类型中取相同的老化叶。每次治疗至少使用三条独立的线进行分析
补充量取决于盆的大小，浇水频率和植物物种。建议在胁迫处理前对一个给定的植物种进行一系列试验

食谱

Hoagland解决方案
注意：Hoagland解决方案基于Hoagland No.2解决方案（Hoagland等，1950）（表1）。

表1. Hoagland解决方案组合
5％（v/v）次氯酸钠
在蒸馏水中加入33ml 15％NaClO溶液，使最终体积为100ml
20％（w/v）PEG6000溶液
将20g PEG6000溶于蒸馏水中
用蒸馏水稀释至终体积为100ml，并混合
200mM氯化钠溶液
将11.7g NaCl溶于1L蒸馏水中

致谢

这项工作得到了中国农业部948项目（2013-Z70），中国国家韧皮纤维种质资源项目（K47NI201A）和中国国家韧皮纤维研究系统（CARS-19-E06）的资助。该协议改编自我们最近的出版物（Niu等人，2015）。

参考文献

Hoagland，DR，Arnon，DI（1950）。水文化方法的成长植物无土。加利福尼亚农业实验站 347：34.
Niu，X.，Qi，J.，Chen，M.，Zhang，G.，Tao，A.，Fang，P.，Xu，J.，Onyedinma，SAand Su，J.（2015） a参照基因选择用于槿麻中的转录物标准化（ Hibiscus cannabinus ） /em> L.）在盐度和干旱胁迫下。 PeerJ 3：e1347。