材料和试剂

培养皿（Corning，目录号：70165-102）
24孔板
硝酸纤维素过滤器（Merck Millipore，目录号：GSWP01300）
8室玻片（ibidTreatμ-载玻片）（ibidi GmbH，目录号：80826）
成熟小鼠（≥2个月大）
用于吸入麻醉的异氟烷（Henry Schein Animal Health，目录号：050031）
70％乙醇
1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）
DMEM/Ham's F-12（WISENT，目录号：319-085-CL）
胎牛血清（WISENT，目录号：920-040）
青霉素/链霉素（WISENT，目录号：450-201-EL）

设备

Dumont＃5切开镊子（Fine Science Tools，目录号：11251-20）
Dumont＃7切开镊子（Fine Science Tools，目录号：11274-20）
解剖剪刀（Moria弹簧剪刀）（Fine Science Tools，目录号：15396-01）
解剖立体显微镜（Leica Microsystems，型号：M125）
CO 2细胞培养孵化器（Sanyo Scientific，型号：MCO-18AIC）
注意：此产品已停产。
安装在荧光立体显微镜（Leica Microsystems，型号：M205FA）上的Infinity-2照相机（Lumenera Corporation）

软件

ImageJ软件

程序

使成熟的小鼠（≥2个月大）过夜，并检查第二天早上阴道塞的存在。中午的阴道塞被观察到被认为是胚胎天（e）0.5。一个典型的实验需要一个野生型夫妇和一对携带突变的研究
十二天后，通过CO 2吸入安乐死异氟醚麻醉的怀孕女性。
使用70％乙醇喷洒小鼠腹部，并用解剖刀打开它访问子宫。
将子宫移入含有15ml无菌冰冷PBS的玻璃培养皿中，并在个体胚胎之间切开。
在另一个装有15ml冰冷PBS的玻璃培养皿中分别处理每个胚胎，在解剖显微镜下使用细镊子去除子宫肌层（图1-步骤1和视频1）。
打开胚外膜以访问胚胎，注意不要切断与连接胚胎到胎盘/超胚胎膜的血管缠结的发育中的肠（图1 - 步骤2和视频1）。
切割胚胎的头，可以用于基于PCR的基因分型，如果必要和打开腹腔（图1-步骤3-4和视频1）。
去除肝脏后，切开食管，将整个胃肠道从腹腔内拉出，同时小心不要损伤仍然附着在肛门上的结肠（图1-步骤5和视频1）。
在肛门切开以消除胃肠道。胃和盲肠将允许跟踪样品的方向（图1 - 步骤6和视频1）。

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strong>视频1.整个解剖过程

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将每个样品转移到含有1ml无菌PBS的24孔板的孔中并保存在冰上。如果需要PCR基因分型，要小心匹配每个样品的肠和头数。
通过将供体（野生型或突变体）和宿主（野生型或突变体）组织沉积并并置在含有15ml无菌冰冷PBS的玻璃培养皿中的小13mm硝酸纤维素膜上，组装每个移植物。以连续的方式制备移植物的每一半，使得第一半在处理第二半之前已经粘附到过滤器。注意在组装的移植物中遵守供体和宿主组织的正常的罗斯特尾尾方向（食管到肛门）。来自选定样品的宿主组织通过切割大约尾部后肠的〜0.5cm部分来制备，而通过在盲肠上游切除中肠的〜0.5cm部分从另一样品制备供体组织。
转移每个移植物承载过滤器在8室幻灯片的室，其含有250μl补充有10％FBS和青霉素/链霉素的DMEM/F12（图2A）。
在培养24小时（37℃，5％CO 2）后，通过测量分离最远端ENCC与中肠 - 后肠移植物的距离来定量中肠衍生的ENCC的非中肠后肠组织的定植（图2B）。

代表数据

图1.解剖程序的关键步骤。步骤1.用细镊子取出子宫肌层。步骤2.打开胚胎外膜以进入胚胎，切割将胚胎连接到胎盘/胚胎外膜的血管。步骤3.切割胚胎头并打开腹腔。步骤4.将整个胃肠道拉出腹腔。步骤5.去除肝脏，切开食管并释放结缔组织的消化道。第6步。通过在肛门切除胃肠道

图2.移植物组装和代表性结果的概述。 A.在8室载玻片的室中，异位e12.5中肠 - 后肠移植物在硝酸纤维素滤膜上的示意图。中肠组织中的红点代表由G4-RFP转基因提供的RFP（DsRed2）荧光标记的ENCC; B.在培养24小时后的移植物的代表性图像（通过虚线描绘），显示通过来自中肠供体组织的荧光标记的ENCC的先前的未愈合的后肠宿主组织的定植。使用安装在Leica M205FA荧光立体显微镜上的Infinity-2照相机拍摄照片，并使用ImageJ软件分析图像。白色箭头指向培养期结束时迁移前沿的位置。比例尺：150μm。

笔记

值得注意的是，当从携带转基因的胚胎（例如，用荧光标记ENCC的G4-RFP转基因（Pilon等人，2008））获取供体组织时，该方法大大简化。在步骤10，这可以允许通过简单的荧光显微镜鉴定突变组织（即，显示延迟的迁移），而不是在移植物组装后等待基因分型结果。此外，在步骤13，这样的内在荧光标记极大地促进ENCC迁移的分析，否则需要使用针对未分化的肠神经祖细胞如Sox10的标记的抗体进行免疫荧光标记。

致谢

Pilon实验室由加拿大健康研究所（CIHR），加拿大自然科学和工程研究委员会（NSERC）和大学基金会皮埃尔·拉瓦耶（Fondation du granddéfiPierre Lavoie）资助。 RS拥有来自魁北克省魁北克省（FRQS）的研究金，而NP则是FRQS少年2研究学者，也是UQAM罕见遗传疾病研究主席的接受者。作者感谢Breau等人进行的创新工作。（2006），本协议是基于。

参考文献

Bergeron，KF，Silversides，DW和Pilon，N。（2013）。 Hirschsprung's disease的发育遗传学。 83（1）：15-22。
Breau，MA，Pietri，T.，Eder，O.，Blanche，M.，Brakebusch，C.，Fassler，R.，Thiery，JP和Dufour，S。（2006）。在肠神经嵴细胞缺乏β1整合素导致Hirschsprung样表型。 133（9）：1725-1734
Obermayr，F.，Hotta，R.，Enomoto，H.and Young，HM（2013）。肠道神经系统的发育和发育障碍。 Nat Rev Gastroenterol Hepatol 10（1）：43-57。
Pilon，N.，Raiwet，D.，Viger，RS和Silversides，DW（2008）。在内细胞群和迁移性神经嵴细胞的细胞内的Gata4的新的前和后 - 胃泌腺表达。 Dev Dyn 237（4）： 1133-1143。
Soret，R.，Mennetrey，M.，Bergeron，KF，Dariel，A.，Neunlist，M.，Grunder，F.，Faure，C.，Silversides，DW，Pilon，N.and Ente-Hirsch Study，（2015）。一种胶原VI依赖性致病机制Hirschsprung氏病。 125（12）：4483-4496。