材料和试剂

常规重量（棕色）发芽纸48.5"×36.5"，定制尺寸为12"×24"（Anchor Paper Company，目录号：SD3836S）
小厨房丝网过滤器/带手柄的筛（直径20厘米）
小的塑料杯，测量船（Fisherbrand TM六角形聚苯乙烯称量皿）（Thermo Fisher Scient，Fisher Scientific，目录号：02-202-101）或用于干燥种子的双面滤纸与条目数
相同的数字
防水铅笔艺术握持水彩画黑色（Faber-Castell，目录号：114299）和永久标记（Sharpie ，Fine Point Permanent Marker，黑色）
注意：黑标记效果更好，因为其他颜色褪色更快。
塑料标签（5"x 5/8"）（国际温室，目录号：CN-1000）用于标签（如果卷标有标签，则可选）
橡胶带（OfficeMax Extra Long橡皮筋或任何其他品牌）
玻璃纸袋（Seedburo S411拍摄袋，处理，4"×2-1/2"×11"）
个人防护用品：乳胶手套，实验服，闭合鞋，口罩护目镜
玉米种子：本方案中使用的基因型是从位于爱荷华州阿姆斯市的北部中央区域植物介绍站获得的纯品系（Abdel-Ghani等人，2013）。
注意：

在相同条件下种子应该被繁殖以避免由于环境对种子大小的差异。
种子应该显示高的萌发百分比，以在实验单位内保持相似数量的生物复制。

Chlorox ®溶液（6％次氯酸钠），家用漂白剂（美国）
去离子无菌蒸馏水（ddH 2 O）
硝酸钾（KNO 3）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：P-263-500）
硝酸钙[Ca（NO 3）2]（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：C109-3）
磷酸二氢钾或磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP-362-500）
硫酸镁（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：M65-500）
来自铁螯合物的铁[Fe-EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E6760-100G），Fe-DTPA或Fe-EDDHA]
磷酸一钙或磷酸二氢钙[Ca（H 2 PO 4）2]（MP Biomedicals，目录号：193803）
硫酸钙二水合物（CaSO 4·2H 2 O）（MP Biomedicals，目录号：191414）
硫酸钾（K 2 SO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P0772-1kg）
硼酸（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP168-1）
氯化锰-4水合物（MnCl 2·4H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：221279-100g）
硫酸锌-7水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：Z0251-100G）
硫酸铜-5水合物（Thermo Fisher Scientific，Fisher Science，目录号：S25287A）
钼酸（H 2 MoO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：232084-100G）
Hoagland的营养液

Hoagland的解决方案（见配方），高N（15mM NO 3 - ）
Hoogland解决方案（见配方）低N（1.5mM NO 3）
微量营养素储备溶液（1 L）（参见配方）

30％乙醇（C 2 H 6 O）（任何品牌的商品级）（参见配方）
2.5g/L杀菌剂溶液Captan （Bonide Products Inc.）（参见配方）

设备

2L容量烧杯（每个烧杯装有8-10个纸卷）（Coring，Pyrex Griffin Beakers，目录号：10000-2L）。
用于灭菌和洗涤种子（Sigma-Aldrich，目录号：CLS100050）的容量为50ml的烧杯（Pyrex？，Griffin Beakers）
植物生长室（Conviron，型号：PGC FLEX）
冷室（Rheem Puffer Hubbard环境室）或冰箱
高压釜（PRIMUS Strerilizer，型号：PSS5）
敏感平衡（Ohaus，型号：Adventurer TM AR0640）
注意：此产品已停产。
平板扫描仪（Epson，型号：Expression 10000 XL或任何其他品牌）
带闪存驱动器和Windows操作系统的计算机
通用加热和干燥箱（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，型号：15-103-0503）或任何恒温烘箱/干燥器
的Fisher Scientific TM />
尺子或尺子（Acme Westcott 15728 36"铝杖棒"）

软件

WinRhizo（Regent Instruments，型号： WinRhizo Pro 2009 ）或 ARIA（自动根图像分析）（Pace et al 。，2014）

程序

该实验设计用于在对比的氮（N）水平下测试玉米幼苗的性能（Abdel-Ghani等人，2013）。幼苗应暴露于具有高N（HN）和低N（LN）的Hoagland营养液（Hershey，1994）。在具有HN的Hoagland氏溶液中的氮含有15mM的NO 3+，而LN Hoagland's溶液中的N浓度为1.5mM（10％NO 3 - sub> - ）（Abdel-Ghani等人，2013; Abdel-Ghani等人，2015）。其他宏观和微观元素在营养处理中应该是恒定的。关于纸卷准备和培养的所有步骤如下（还参见图1;步骤A至D）

图1.纸卷准备和培养步骤的总结 A.将玉米用6％次氯酸钠进行表面灭菌，用蒸馏水洗涤并干燥。将四个相似大小的灭菌的玉米籽粒放置在用杀真菌溶液Captan预湿润的双层棕色滤纸上。 B.将卷发芽纸保存在含有具有高氮（HN）和低氮（LN）的Hoagland营养液的2L玻璃烧杯中。 C.卷须在受控生长室中保存14天。 D.在受控生长室中在LN和HN处理下培养14天后的幼苗

玉米籽粒灭菌
1. 在室温下，将核在20ml烧杯中用Chlorox溶液（6％次氯酸钠）表面灭菌15分钟。 Chlorox应该覆盖烧杯中的内核，烧杯应该手动摇动3-4次
2. 首先应该排出氯氧化物，然后将种子用ddH 2 O 3洗涤三次。小的无菌筛（直径20cm）可以在每次洗涤后用于排出水。
3. 洗涤后，应将玉米放在双面棕色滤纸上，放置10分钟，直至种子干燥。小塑料杯或测量船也可用于干燥种子
在纸卷中种植种子
1. 将棕色发芽纸切成20×20cm的片，并用杀真菌溶液Captan（2.5g/L）预湿润以消除任何真菌发展的可能性在幼苗发育期间。棕色纸应该用杀真菌溶液浸湿，将纸浸泡在溶液中。应通过用手压在浸泡的纸上除去过量的杀真菌剂溶液。纸卷应该用永久（防水）铅笔标记，直接在棕色纸上书写和/或在每卷上贴上标签。
2. 将相似大小的四个灭菌的玉米籽粒置于离双层滤纸的顶部边缘4cm处。将核放置4cm，离开左边缘和右边缘4cm，用另一滤纸覆盖，然后包裹成约5cm厚的卷。卷筒应该用橡胶带固定。含有高压灭菌的Hoagland营养液（含有HN或LN）的两升容量玻璃烧杯应当填充至一半（约400ml），因此棕色纸卷应该垂直放置在烧杯中，确保种子在顶部，而不是浸没在溶液中。大约一半的辊长度应该在溶液中出现。每个烧杯可放置八至十个卷。所有步骤如图1A-D所示
生长条件
辊应该保持在受控的生长室中在以下条件下（图1D）：在25/22℃下16/8小时（光/暗）的光周期，具有200μmol光子m -2的光合有效辐射 s -1 。生长室中的相对湿度应保持在65％。应该每天添加营养溶液，以在实验期间将烧杯中的溶液水平维持在400ml。幼苗应在生长室中保持14天。此后，可以手动或使用图像分析软件记录玉米根系结构相关性状
记录玉米根构造
在HN和LN水平下生长的玉米籽粒孵育14天后，应去除营养溶液并用约400ml的30％乙醇代替，并且样品应储存在冷室中，仅取出用于测量，扫描和干燥。这样做是为了防止进一步生长以保留根并在相同的时间点记录根数据。但是，如果可以在一天内扫描所有根，则不需要此步骤。为了使用软件测量根性状，使用平板扫描仪扫描根并尽可能地保存图像，确保根不重叠，以便于测量。在每个条目的4个幼苗中，测量看起来相似的3个。在干燥根之前应进行扫描。
1. 手工记录的性状：个体幼苗的根应该用刀片分为三部分，即主根，根根和冠根（图2）。玉米根性状可以通过直尺或重量分析记录。主根，根根和冠根的长度可以用尺子记录。半数根数和冠根数可以通过计数上升根来记录。还可以使用敏感平衡记录嫩芽和根的新鲜重量。将新鲜根置于玻璃纸袋（10×20cm）中，并在80℃下烘干至少48小时。干燥后可以使用敏感的天平测量干重。
  
  图2.玉米根系：胚根（初级根和精根）和胚后根（茎生根冠根和侧根）。冠根负责水和营养物摄取的主要部分。所有这些根都通常在土壤下形成
2. 由WinRhizo程序记录的性状：根尖，叉和杂交的总数，总根长度，根表面积，根体积和根平均直径可使用图像分析软件测量。软件不能自己区分主，根，冠或侧根。如上一步所述，根必须分为原，根和冠根;然后，可以进行特定根测量。使用WinRhizo软件进行根成像分析的步骤如图3-17所示。
  1. 打开扫描仪电源，打开WinRhizo程序并选择要使用的扫描仪（应突出显示），然后单击"选择"（图3）。
    
    图3. WinRhizo中的扫描仪（图像源）选择
  2. WinRhizo的标题窗口将打开。单击"确定"（图4）。
    
    图4. WinRhizo启动页。单击"确定"继续。
  3. 扫描和保存根图像
    1. 在扫描仪上放置最多3根。根系统可以被完全扫描，或者在非常密集和紧凑的根系统的情况下可以执行解剖根部部分的单独扫描。确保来自一个植物的根与其他植物的根不相互缠绕，因为这影响分析。
    2. 从主选项卡，单击"图像"，然后单击"获取图像"（图5）
      
      图5. WinRhizo中的图像采集。点击"图像>采集图像"后，扫描根目录。
    3. 扫描完成后，根图像将显示在屏幕上。检查图像（图6）。
      
      图6.从WinRhizo软件扫描的根图像预览
    4. 通过单击"图像"，然后单击"保存显示的图像"保存扫描的图像。
  4. 分析扫描的根图像
3. 由ARIA程序记录的性状：使用ARIA程序的根成像分析的步骤在图17中示出。通过软件一次进行测量。加载图像并单击图像上的主根（对于其他根也可以这样做），软件将开始同时测量所有性状。以下性状及其相应描述可以使用ARIA来测量（Pace等人，2014）。

代表数据

在LN和HN水平下显示基因型PHZ51，B73和Mo17的幼苗生长的代表性数据显示于图18中。玉米基因型通过增加根：苗（R：S）比率对N缺乏有反应。与HN处理相比，图18中显示的线显示LN下的更高的R：S比。为了在LN下吸收足够量的N，玉米植物通过增加根体积和减少空中营养生长来适应N饥饿。

图18.在低和高氮水平下的三种玉米基因型（PHZ51，B73和Mo17）的性能

食谱

Hoagland的营养液
注意：这基本上根据Hoagland和Arnon（1950）。该溶液用于在水培培养基中培养植物。

高N（15mM NO <3> - ）Hoagland解决方案
5ml 1M（M =摩尔）硝酸钾 5ml的1M硝酸钙
1ml 1M磷酸二氢钠
加入2ml 1M硫酸镁 1毫升微量营养素储备溶液（见下面的配方1c） 5毫升来自铁螯合物（Fe-EDTA，Fe-DTPA或Fe-EDDHA）的1,000毫克/升铁
添加ddH ₂ O即可完成体积为1 L
低N（1.5mM NO <3> - ）Hoagland's溶液
10ml 0.05M磷酸二氢钙
200ml 0.01M硫酸钙二水合物 5ml 0.5M硫酸钾加入2ml 1M硫酸镁 1毫升微量营养素储备溶液（见下面的配方1c） 5ml HN螯合物储备溶液添加ddH ₂ O即可完成体积为1 L
微量营养素储备溶液（1 L）
2.86g硼酸 1.81克氯化锰-4水合物 0.22克硫酸锌-7水合物 0.08克硫酸铜-5水合物 0.02g 85％钼酸加入高压灭菌的ddH _{2 O，使体积达到1 L}

30％乙醇（1L）通过搅拌加入在500ml ddH 2 O中逐渐加入300ml乙醇添加ddH _{2 O直到最终体积为1000ml
存储在4°C}
2.5 g/L杀菌剂溶液Captan ®
通过搅拌，在500ml ddH 2 O中溶解25g Captan 添加ddH _{2 O直到最终体积为1000ml
在室温下贮存}

致谢

该协议开发时，Adel Abdel-Ghani博士是访问富布莱特博士后研究员，并在约翰Mu'tah大学在2011-2012学年期间在爱荷华州立大学（ISU），美国阿姆斯，美国休假期间休假。作者还要感谢美国农业部国家粮食和农业研究所（项目编号：IOW05180）和RF Baker植物育种中心为这项工作提供资金。

参考文献

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